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录入时间:2020-3-27 9:37:20 来源:2020年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册(下卷) - 微生物方法SOP

1   方法来源

    GB 4789.29-xxxx《食品安全国家标准 食品微生物学检验 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检验》。

 

2   适用范围

    本程序规定了食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检验方法。


3   设备和材料

3.1   实验室常规灭菌设备。

3.2   冰箱:2℃~8℃、-20℃~-30℃。

3.3   恒温培养箱:26℃±1℃、36℃±1℃。

3.4   恒温水浴锅:46℃±1℃。

3.5   显微镜:10倍~100倍。

3.6   均质器。

3.7   离心机:3000r/min。

3.8   电子天平:感量0.1g。

3.9   比浊计。

3.10  锥形瓶:容量100 mL、500 mL。

3.11  无菌培养皿:直径90mm、直径150mm。

3.12  无菌透明玻璃纸、滤纸。

3.13  无菌灌胃器:1mL。

3.14  微生物生化鉴定系统。

3.15  小鼠:18g~20g,每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。


4   培养基和试剂

4.1  GVC增菌液:见A.1。

4.2  改良马铃薯葡萄糖琼脂(mPDA):见A.2。

4.3  PCFA培养基:见A.3。

4.4  马铃薯葡萄糖琼脂(PDA):见A.2.1。

4.5  马铃薯葡萄糖半固体琼脂:见A.4。

4.6  卵黄琼脂:见A.5。

4.7  革兰氏染色液:见A.6。

4.8  氧化酶试剂:见A.7。

4.9  Hugh-Leifson培养基(O/F试验用):见A.8。

4.10  蛋白胨水(靛基质试验用):见A.9。

4.11  缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用):见A.10。

4.12  西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.13。

4.13  苯丙氨酸培养基:见A.14。

4.14  糖发酵管:见A.15。

4.15  半固体琼脂:见A.16。

4.16  抗O多价血清、型特异性因子血清(O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ型、O-Ⅷ型)。

4.17  生化鉴定试剂盒。


5   检验程序

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检验程序见图1。

6  操作步骤

6.1  样品处理

无菌操作称取25g(mL)样品,置入盛有225mLGVC增菌液的无菌均质袋中(鲜银耳样品取1g,用剪刀剪碎,加入盛有20mLGVC增菌液的无菌均质袋中),用拍击式均质器拍打1min~2min;或置入盛有225mLGVC增菌液的无菌均质杯中,以8000r/min~10000r/min均质1min~2min;若样品为液态,振荡混匀。

6.2  增菌

将上述样品增菌液置36℃±1℃培养20h~24h。

6.3  分离

用直径3mm的接种环取增菌液一环,分别划线接种于mPDA平板和PCFA平板,36℃±1℃培养24 h~48 h。观察各个平板上生长的菌落,各个平板上菌落特征见表1。

表1 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在不同分离平板上的菌落特征

培养基

菌落特征

mPDA 平板

培养24 h后,菌落1 mm~2 mm,紫色,光滑、湿润、边缘整齐。培

养48 h后,部分菌落中心可有凸起呈草帽状。

PCFA 平板

培养24h后,菌落0.5mm~1mm,灰白色,光滑、湿润、边缘整齐。

卵黄琼脂平板

培养24 h后,菌落2 mm~3mm,表面光滑、湿润,培养48 h后,菌

落周围形成乳白色混浊环,斜射光下可见菌落及周围培养基表面呈虹彩现象。

 

6.4  初筛试验

自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落(低于5个全选),分区划线接种于卵黄琼脂平板,36℃±1℃培养。挑取培养18~24 h的菌落进行革兰氏染色及氧化酶试验。对于革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性的菌继续培养至48 h±2 h,对于卵磷脂酶阳性,带有虹彩环的单个菌落,接种PDA平板,36℃

±1℃培养24 h±2 h。

6.5  生化试验

从纯培养的PDA平板上挑取菌苔进行生化鉴定。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生化特征见表2。可选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。

表2 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生化特征

生化试验

特 征

O/F 试验(氧化型)

+

              氧化:

葡萄糖

+

果糖

+

木糖

+

半乳糖

+

蔗糖

-

阿拉伯糖

+

甘露醇

+

侧金盏花醇

+

肌醇

+

卫茅醇

+

动力

+

卵磷脂酶

+

氧化酶

-

尿素

+

明胶液化

+

硝酸盐还原

+

柠檬酸盐利用

+

精氨酸

+

石蕊牛乳

+

靛基质

-

V-P

-

MR

-

苯丙氨酸脱氨酶

-

H2S 产生

-

注:+表示阳性;-表示阴性。


6.6  血清学分型鉴定(可选择项)

6.6.1  菌体抗原的制备

将PDA平板36℃±1℃培养24 h±2 h 的培养物用无菌生理盐水洗下,沸水浴(100 ℃)2h,3000r/min10min离心弃上清液,再用无菌生理盐水稀释至5×108~109 CFU/mL菌悬液,作为凝集试验用抗原。

6.6.2  菌体抗原的鉴定

用多价血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者, 依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清做试管凝集试验。根据试验结果,判定菌体抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化特征符合,但不能与以上血清凝集者,需保留菌株做进一步鉴定。

6.7  毒性试验

6.7.1 产毒培养

将初步鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的菌株接种PDA平板,36℃±1℃, 培养24 h±2 h,用灭菌接种环刮取适量菌苔,加到3mL无菌生理盐水的试管中, 配成1麦氏浓度(McFarland,MCF)的菌悬液(约为108CFU/mL),用无菌吸管吸取0.5mL,滴在铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板上,用无菌L棒涂布均匀,26℃±1℃培养5 d。取下带菌的玻璃纸,将半固体平板置于100℃流动蒸汽灭菌30 min。室温冷却后,置-20℃~-30℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化,用无菌吸管吸出冻融液,经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中(此为毒素粗提液),4℃避光保存。

同时,将未接种菌苔、铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板作为阴性对照,按照同样的试验方法制备阴性对照粗提液,4℃避光保存。

6.7.2 毒力测定

取毒素粗提液或经100℃水浴蒸发后的5~10倍浓缩液,灌胃小鼠3只,每只 0.5 mL,观察至7 d。若菌株产生米酵菌酸,小鼠在灌胃后20 min~24 h内发病。主要症状为竖毛、萎糜不振、躁动,继而行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐,呈角弓反张状,呼吸急促、死亡。

取阴性对照粗提液或经100℃水浴蒸发后的5~10倍浓缩液,灌胃小鼠3只, 每只0.5 mL,观察至7 d。小鼠应健康存活。

6.7.3 米酵菌酸测定

毒力测定实验阳性时,分别取毒素粗提液,阴性对照粗提液,按照GB 5009.189执行。

 

7  结果报告

生化试验符合且毒性试验阳性,报告检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种);生化试验和毒性试验有一项不符合,报告未检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)。

 

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