结核病的症状和体征往往不典型，虽可借助X线摄片诊断，但确诊仍有赖于细菌学检查。
1、标本根据感染部位而定。如肺结核采取咳痰（最好取早晨第一次咳痰，挑取带血痰或脓痰）；肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；肠结核取粪便；结核性脑膜炎取脑脊液（CSF）；脓胸、胸膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓汁或分泌物。待检标本一般应先集菌后检查。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4%NaOH（痰和碱的比例为1：4，尿、支气管灌洗液和碱的比例为1：1）处理5min。处理后的材料再离心沉淀，取沉淀物做涂片染色镜检。若需进一步做培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。
2、直接涂片镜检标本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。为加强染色，可将标本用苯酚复红染色过夜，用0.5%(盐酸乙醇脱色30s，包括大多数结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性，也可用金胺染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈现金黄色荧光。
3、分离培养将集菌并经中和后的标本接种于Lowenstein培养基37℃培养，每周观察生长情况，通常2—4周长出肉眼可见的粗糙型菌落。根据细菌的生长速度、菌落特征、产生色素情况以及抗酸性染色强弱的程度等特征做出判断。由于抗结核药物的使用，患者标本中常分离出结核分枝杆菌L型，故多次检出L型亦可作为结核病活动的判断标准之一。痰培养比涂片敏感，少至10个/ml的结核分枝杆菌也可被检出。通常情况下，培养的敏感性为80%—85%，特异性大约在98%。
4、动物试验常用豚鼠或地鼠鉴别疑似结核分枝杆菌的分离培养物和进行毒力测定。取经浓缩集菌处理的样本1.0ml注射于豚鼠或地鼠腹股沟皮下，经3—4周饲养观察，如出现局部淋巴结肿大，消瘦或结核菌素试验阳性，可及时剖检，并做涂片或分离培养。
5、快速诊断一般涂片检查菌数需5000—50000/ml，培养需100/ml，标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果，且培养需时较长。而目前用于结核病早期和快速诊断的PCR方法，对菌量少，或细菌发生L型变异而不易培养成功的标本，其敏感性在75%—88%，特异性高达100%。PCR技术能特异性地扩增结核分枝杆菌核酸片段达到鉴定结核分枝杆菌的目的，并在1—2d内可获阳性结果，但PCR过程中应注意污染等问题，防止出现假阳性或假阴性结果。此外，可用ELISA法检查结核分枝杆菌抗体；也可使用BACTEC法，以含“C棕榈酸做碳源底物的H。Z培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌，5—7d就可出报告；芯片技术可用于结核分枝杆菌耐药性的立博球探论坛。
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