1．分析目标化合物
丁嘧脲, 丁嘧脲尿素体, 丁嘧脲甲烷亚氨基酰胺体
2．仪器设备
带碱热离子立博球探论坛器或高灵敏度氮磷立博球探论坛器的气相色谱仪、带紫外分光光度立博球探论坛器的高效液相色谱仪、气相色谱-质谱仪和液相色谱-质谱仪。
3．试剂
L-半胱氨酸盐酸盐溶液
碳酸钾溶液
乙腈
2％二甘醇丙酮溶液
乙醚
正己烷
0.1mol/L 乙酸缓冲溶液(pH5.0)：在0.1mol/L乙酸钠溶液中加入0.1mol/L乙酸溶液，调整pH5.0。
丁嘧脲标准溶液：在10.0mg丁嘧脲中加入乙腈至200mL，吸取其10mL，加入乙腈：水(9：1)混合溶液至100mL。
4．标准品
丁嘧脲标准品：含丁嘧脲99％以上，熔点为145℃～148℃。
1－特丁基－3－(2，6－二异丙基－4－苯氧基苯基)尿素(以下称“尿素体”。)标准品：含尿素体97％以上，熔点为180℃～181℃。
1－特丁基－3－(2，6－二异丙基－4－苯氧基苯基)甲烷亚氨基酰胺(以下称“甲烷亚氨基酰胺体”。)标准品 ：含甲烷亚氨基酰胺体97％以上，熔点为126℃～127℃。
5．试验溶液的制备
a 丁嘧脲试验溶液
① 提取方法
（I）种子类
将样品粉碎通过420μm的标准网筛后，称取其8.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和15mL 1mol/L碳酸钾溶液,放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至200mL棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
将样品搅碎后，称取其20.0g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液、10mL 1mol/L碳酸钾溶液和80mL乙腈，搅拌1分钟后，振荡30分钟，用玻璃纤维滤纸抽滤至200mL棕色三角瓶中。滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
样品粉碎后，称取其5.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和10mL 1mol/L碳酸钾溶液, 放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至200mL棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 净化方法
（I）种子类、水果和蔬菜
在用铝箔包裹避光的环已基甲硅烷基化硅胶小柱(1,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，弃去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈，准确至4mL，此为试验溶液。
（II）茶
在用铝箔包裹避光的环已基甲硅烷基化硅胶小柱(2,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，弃去流出液。再注入15mL乙腈：水(4：1)混合溶液，收集流出液。加入15mL水。
氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(1,000mg)下面连接环已基甲硅烷基化硅胶小柱(1,000mg)。注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。注入上述溶液后，弃去流出液。再注入10mL乙腈：水 (2：3) 混合溶液，弃去流出液。取下弃去氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱。环已基甲硅烷基化硅胶小柱中注入10mL乙腈：水(1：1)混合溶液，弃去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈，准确至4mL，此为试验溶液。
b 尿素体试验溶液
① 提取方法
（I）种子类
将样品粉碎通过420μm的标准网筛后，称取其8.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和15mL 1mol/L碳酸钾溶液,放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
将样品搅碎后，称取其20.0g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液、10mL 1mol/L碳酸钾溶液和80 mL乙腈，搅拌1分钟后，振荡30分钟，用玻璃纤维滤纸抽滤至200mL棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角烧瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
样品粉碎后，称取其5.00g于300mL具塞的棕色三角烧瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和10mL 1mol/L碳酸钾溶液, 放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 净化方法
（I）种子类
在用铝箔包裹避光的环已基甲硅烷基化硅胶小柱(1,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，弃去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈至4mL。移取3mL溶液于棕色磨口减压浓缩器中，加入0.5mL 2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。残留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
硅胶小柱(避光，690mg)中注入5mL正己烷，弃去流出液。柱中注入上述溶液，弃去流出液。注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液，弃去流出液。在此柱的下部先注入5mL正己烷，弃去流出液，连接氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(360mg)。硅胶小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷，残留物中加入乙腈溶解，准确至2mL，做为试验溶液。试验溶液制备后必须立即测定。
（II）水果和蔬菜
环已基甲硅烷基化硅胶小柱(遮光、1,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。再注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，弃去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈至4mL。移取2mL溶液于棕色磨口减压浓缩器中，加入0.5mL2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。残留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
硅胶小柱(避光690mg)中注入5mL正己烷，弃去流出液。在柱中注入上述溶液，弃去流出液，注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合液，弃去流出液。此柱的下部连接预先注入5mL正己烷，弃去流出液的氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(360mg)。硅胶小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。残留物中加入乙腈溶解，准确至2mL，此为试验溶液。试验溶液制备后必须立即测定。
（III）茶
环已基甲硅烷基化硅胶小柱(遮光、2,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合液，弃去流出液。再注入15mL乙腈：水(4：1)混合液，收集流出液，加入15mL水。
氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(遮光，1,000mg)下面连接环已基甲硅烷基化硅胶小柱(遮光1,000mg)。注入乙腈10mL，弃去流出液。再注入水10mL，弃去流出液。柱中注入上述溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3) 混合溶液，弃去流出液后，取下弃去氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱。环已基甲硅烷基化硅胶小柱中注入10mL乙腈：水(1：1)混合溶液，弃去流出液。再注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈，准确至4mL。移取2mL溶液于棕色磨口减压浓缩器中，加入0.5mL 2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。残留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
硅胶小柱(遮光、690mg)中注入5mL正己烷，弃去流出液。柱中注入上述溶液，弃去流出液。注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液，弃去流出液。此柱的下部连接预先注入5mL正己烷，弃去流出液的氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(360mg)。硅胶小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。残留物中加入乙腈溶解，准确至2mL，此为试验溶液。试验溶液制备后必须立即测定。
c 甲烷亚氨基酰胺体试验溶液
① 提取方法
（I）种子类
将样品粉碎通过420μm的标准网筛后，称取其8.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和15mL 1mol/L碳酸钾溶液,放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
将样品搅碎后，称取其20.0g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液、10mL 1mol/L碳酸钾溶液和80mL乙腈，搅拌1分钟后，振荡30分钟，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
样品粉碎后，称取其5.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和10mL 1mol/L碳酸钾溶液, 放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 净化方法
在十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱(避光1，000mg)中注入10mL乙腈,弃去流出液。再注入30mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入30mL水，弃去流出液。注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入20mL乙腈：0.1mol/L乙酸缓冲溶液(pH5.0) (4：1)的混合溶液,收集流出液于100mL三角瓶中。
流出液中加入100mL 5％氯化钠溶液,再用50mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液移入200mL分液漏斗中, 用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，乙酸乙酯和正己烷层移入200mL三角瓶中。水层中加入50mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液，按上述同样方法操作，合并乙酸乙酯和正己烷层于上述三角瓶中。加入适量无水硫酸钠，不时振荡、混合，放置15分钟后，滤入磨口减压浓缩器中。再用20mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液洗涤三角瓶，以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物，重复操作二次，合并二洗涤液于减压浓缩器中，加入0.5mL2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙酸乙酯和正己烷。残留物中加入丙酮溶解，准确至3mL，此为试验溶液。
6．操作方法
a 定性试验
① 丁嘧脲试验
用带紫外分光光度立博球探论坛器的高效液相色谱仪，按下列操作条件进行试验。试验结果必须与丁嘧脲标准溶液的一致。
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm，细孔径30nm)。
柱：内径6mm，长150mm不锈钢管。
柱温： 40℃
立博球探论坛器：波长256nm。
流动相：乙腈：水：甲醇(2：2：1)混合溶液。调整流速使丁嘧脲约32分钟流出。
② 尿素体试验
用带紫外分光光度立博球探论坛器的高效液相色谱仪，按下列操作条件进行试验。试验结果必须与标准品的一致。
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm)。
柱：内径6mm，长150mm不锈钢管。
柱温： 40℃
立博球探论坛器：波长235nm。
流动相：乙腈：水：甲醇(2：2：1)混合溶液。调整流速使尿素体约20分钟流出。
③甲烷亚氨基酰胺体试验
用带碱热离子立博球探论坛器或高灵敏度氮磷立博球探论坛器的气相色谱仪，按下列操作条件进行试验。试验结果必须与标准品的一致。
操作条件
柱：内径0.25mm、长30m的石英毛细管，涂布0.25μm厚气相色谱用50%苯基--甲基硅酮，老化。
柱温：在100℃保持1分钟，此后每分钟升温30℃。达到280℃后保持4分钟。
进样器温度：250℃
立博球探论坛器温度：280℃
气体流量：以氦气为载气。调整流速使甲烷亚氨基酰胺体约10分钟流出。调节空气和氢气的流量至适当条件。
b 定量试验
根据与a 定性试验相同操作条件所得试验结果，用峰高法或峰面积法对丁嘧脲、尿素体和甲烷亚氨基酰胺体进行定量，求出各含量，按下式求出包括尿素体和甲烷亚氨基酰胺体的的丁嘧脲含量。
丁嘧脲的含量(包适尿素体和甲烷亚氨基酰胺体)＝A＋B×1.04＋C×1.09
A：丁嘧脲的含量(mg/kg)
B：尿素体的含量(mg/kg)
C：甲烷亚氨基酰胺体的含量(mg/kg)
c 确证试验
对于丁嘧脲和尿素体的试验溶液，按照与a 定性试验相同的操作条件，用液相色谱--质谱仪测定。试验结果必须与标准品的一致。此外，必要时用峰高法和峰面积法进行定量。
对于甲烷亚氨基酰胺体的试验溶液，按照与a 定性试验相同的操作条件，用气相色谱--质谱仪测定。试验结果必须与标准品的一致。此外，必要时用峰高法和峰面积法进行定量。
7．定量限
水果和蔬菜：0.02 mg/kg，种子：0.04 mg/kg，茶：0.2 mg/kg
8．注意事项
1）分析值
对丁嘧脲、尿素体和甲烷亚氨基酰胺体分别进行定量，将尿素体和甲烷亚氨基酰胺体含量乘以系数换算成丁嘧脲的含量。它们的和为丁嘧脲分析值。
2）丁嘧脲在光和水中非常不稳定，试验必须始终在避光条件下进行，严禁使用旋转蒸发仪。此外，不需磨碎、切细的冷冻保存样品解冻后，不能作为再度试验的样品。因磨碎样品中经常加重丁嘧脲的分解，提取前直接进行均质。尿素体和甲烷亚氨基酰胺体的试验溶液稳定。对于丁嘧脲的试验溶液不稳定的作物，配制后保存在冷冻库中，最好迅速测定。
附：丁嘧脲尿素体〔1－特丁基－3－（2,6－二异丙基－4－苯氧基苯基）尿素〕
丁嘧脲甲烷亚氨基酰胺体〔1－特丁基－3－（2,6－二异丙基－4－苯氧基苯基）甲烷亚氨基酰胺〕
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