立博国际，立博官网，立博国际官网，立博指数，立博威廉，立博球探，立博论坛，立博网址-厌氧菌微量生化板的研制

作者：李建秋　　　吴晓岩　　　熊德鑫　

摘　要：利用预成酶的原理，研制厌氧菌微量生化鉴定板，用国际标准菌株立博球探论坛其符合率达95.9%，重复率达96.33%。用已知引进参考菌株立博球探论坛，其符合率达94.84%，重复率达94.33%，而对临床分离的革兰阴性细菌的符合率达81%，对临床分离的革兰阳性细菌符合率达90%，此法效果与国外API-20A产品效果类似，但此法具有快速，操作简便，重复性好等优点，值得在广大临床立博球探论坛中推广和普及。

　　 关键词：厌氧菌　微量生化板　快速诊断

　　早在70年代，我们就采用微量技术对微生物生化性状进行立博球探论坛，以鉴定微生物的种属。从简易装置开发原理来说，它大致包括两大类产品，一类属于微量接种生长繁殖，再与培养基底物产生反应而用于微生物的生化性状的鉴定，这类装置与传统的微管法类似，如API微量系统，它就是利用微型杯的塑料板，干燥底物，使用时往杯中滴入菌悬液，经过培养一段时间后，再观察其培养基中指示剂改变情况。API系统根据对不同类细菌鉴定的需要又分成4大类，如AIP-20A系统用于鉴定厌氧菌，API-20C用于鉴定酵母菌，此套系统对厌氧菌鉴定的符合率为(80～90)%。另一大类快速生化立博球探论坛装置是利用预成酶的原理，根据酶与底物的专一性反应，不需依赖细菌生长，而能快速鉴定厌氧菌的生化性状，如国内熊德鑫教授的微量生化板法。我们依据微量生化板法原理加以改良，开发出“厌氧菌微量生化板”用于部分菌种鉴定，结果报告如下：

　　1　材料与方法

　　1.1　根据资料^［3］　配制简易生化鉴定20A厌氧菌生化板若干。

　　1.2　指示剂的配置　溴麝香草酚蓝-甲基红指示剂，又简称为BTB-MR液，甲基红溶液：称取甲基红20g，缓冲液加入0.02mol/L，NaOH约30ml，不研磨直至甲基红完全溶解，加蒸馏水至100ml，储存于棕色瓶中放冰箱保存。0.4%溴麝香草芬蓝溶液，称取TBT0.4g，缓冲液加入0.02mol/L naOH约(30～35)ml，研磨直至完全溶解，加蒸馏水至100ml，储存于棕色瓶中放冰箱保存。临用时将上述两种试剂分别用蒸馏水稀释5倍后1∶1混合即可使用。

　　1.3　操作

　　1.3.1　被检菌液的制备　从厌氧培养48h培养物用无菌棉签洗至无菌试管中，测定菌液OD值为4.0～8.0(相当于15亿/ml～30亿/ml)。

　　1.3.2　加入菌液　现将制备菌液置振荡器上振荡(10～20)sec，使其混均后再用灭菌巴氏管将菌液加入微量反应板小孔中，将反应板置湿溶器盒内35℃普通培养箱(4～6)h后观察结果。

　　1.3.3　每次试验都设阴性和阳性对照　阴性对照用PBS液加入，内含指示剂为浅绿色；阳性对照：吲哚试验，具核梭杆菌具核亚种ATCC25586，七叶水解，脆弱类杆 菌ATCC25285，硝酸盐还原：痤疮丙酸杆菌(本室分离株)；触酶试验：使用脆弱类杆菌ATCC25285；尿素酶：使用本室分离的类杆菌。

　　1.4　结果判定

　　1.4.1　糖发酵试验　每个试验孔加入BTB-MR液一滴，砖红色为强阳性(++)，黄色为(+)，绿色为阴性(-)。

　　1.4.2　吲哚试验　加Kovacs试剂1滴，出现粉红色为阳性，无颜色为阴性。

　　1.4.3　硝酸盐还原试验　先加入A试剂(0.5%α-奈胺后加入B试剂(0.8%磺胺酸)各一滴，出现红色为阳性(+)，无颜色为阴性。

　　1.4.4　七叶苷水解　黑色为阳性(+)，无色为阴性(-)。

　　1.4.5　尿素酶　粉红色为阳性(+)，橙黄色为阴性(-)。

　　1.4.6　触酶产生　在甘露醇中滴入10%H₂O₂，产生气泡者为阳性，不产生气泡为阴性。

　　2　结　果

　　2.2　用国际标准菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化板鉴定结果比较列于表1中。

表1　国际标准菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化板鉴定结果比较

　　2.2　已知参考菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化鉴定结果比较列于表2中。

表2　已知参考菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化鉴定结果比较

　　2.3　对临床革兰阴性菌分离株的鉴定比较列于表3中。

表3　对临床革兰阴性菌分离株的鉴定比较

　　2.4　对临床革兰阳性菌分离株的鉴定比较列于表4中。

表4　对临床革兰阳性菌分离株的鉴定比较

　　3　讨　论　　厌氧菌微量生化板鉴定法是利用预成酶与底物专一反应，不依赖细菌生长既能快速鉴定厌氧菌的生化方法。而API-20A仍然是定量接种被立博球探论坛菌经48h培养生长后，细菌产生特异性酶与加入底物专一反应使pH改变而引起预先加入指示剂改变颜色，以鉴定厌氧菌的生化性状方法。据

　　adeny使用API-20A鉴定系统证实，其符合率(80～90)%，我们使用API-20A对临床分离厌氧菌株鉴定符合率达(83～86)%，与国外鉴定资料类似。我们使用厌氧菌微量生化板鉴定法鉴定国际标准菌株符合率为95.92%，重复率为96.33%，均优于API-20A鉴定方法，并且此法不仅重复率及符合率高，而且具有快速鉴定特点，一般6h即可观察结果，而API-20A法需48h观察结果；同时厌氧菌微量生化板法不需要厌氧培养，置37℃培养箱中(4～6)h即可观察结果。可见厌氧菌微量生化板鉴定方法不需要特殊培养基，试剂用量少，成本低廉，操作简便，不需特殊仪器，待检菌株悬液且可在冰箱中保存一段时间，结果不影响，而API-20A等以往常规的管生化，操作程序繁琐，观察时间一般48h以上，待检菌株不宜保存，一般需立即进行生化鉴定。当然厌氧菌微量生化板结果受菌液浓度的影响，一般菌液浓度OD值在4.0～8.0(约15～30亿/ml)其反应最佳时间(4～6)h，如菌液浓度低于此浓度则需延长反应时间，如菌液浓度过高，而反应时间又长，则可能出现假阳性而使鉴定的符合率降低。总之两种生化鉴定方法各有利弊，但主快速立博球探论坛这点来说还是选择厌氧菌生化反应板鉴定方法为好。

　　作者单位：李建秋　黑龙江省医院，150036

　　吴晓岩　黑龙江省医院，150036

　　熊德鑫　北京解放军304医院，100037

　　参考文献

　　［1］Hansen SL,Stewart RJ.J Cline microboiol,1976,4:227.

　　［2］Moore HB,Sutler VL,Finegold SM.J Cline microbiol 1975,7: 15.

　　［3］熊德鑫编译.厌氧菌分离和坚定方法.江西科技出版社出版，1989，9～11.

　　［4］Adney WS,Jones BL.J Cline Microbial,1985,22(67):980

上一篇：龟分枝杆菌感染的实验室诊断

下一篇：聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种