摘要 单核细胞增生李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌,广泛分布于自然界。针对目前单核细胞增生李斯特氏菌的立博球探论坛现状,总结了4种现行有效的常用立博球探论坛方法,并对各种立博球探论坛方法的优缺点进行了分析比较。实时荧光定量PCR立博球探论坛技术,可精确定量、反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,不需要凝胶电泳过程,避免了扩增产物对环境造成的污染问题,将是未来分析立博球探论坛发展的一个主要趋势。
关键词 单核细胞增生李斯特氏菌;传统立博球探论坛方法;酶联免疫技术;分子生物学技术
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeie monocytogenes 简称L.M;单增李氏菌)是一种人畜共患病病原菌[1],使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。近年来国外报道该菌所致的食物中毒越来越多,病死率高达30%~70%[2-3]。国内也不断有散发病例,引起了国内医学界的普遍关注。WHO在20世纪90年代已将其列为食品四大致病菌之一[4-5]。该菌在自然界分布广泛,以家畜、家禽兽为主要宿主,很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发[6-7]。食品是导致人类受单核细胞增生李斯特氏菌感染的主要传播途径,该菌在4 ℃冰箱保存的食物中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌。在绝大多数食品中都能找到李斯特氏菌,肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源[8]。随着我国冷藏、速冻食品消费量的迅速增多,食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越突出,因此在食品卫生微生物检验中,必须加以重视。现针对其常用立博球探论坛方法的优缺点进行分析比较。
1传统立博球探论坛方法——分离培养
我国于1994年开始发布单核细胞增生李斯特氏菌立博球探论坛的国家标准,即GB/T4789.30-1994。目前,很多立博球探论坛部门和单位在进行食品中单核细胞增生李斯特氏菌的立博球探论坛时,其主要依据依然是国标法。国标GB/T4789.30-1994自从颁布以来,分别进行了3次修订,分别是GB/T4789.30-2003,GB/T4789.30-2008,直至现在正在实行中的GB/T4789.30-2010版本。修订后的GB/T4789.30-2010法,对于样品立博球探论坛依次进行增菌、选择性分离平板分离培养、初筛试验、鉴定等步骤,通过增加API鉴定试验代替生化试验和协同溶血试验。虽然近年来显色培养基的应用和ATB生化鉴定仪的联合使用已大大简化了鉴定步骤,缩短了立博球探论坛周期,但由于ATB生化鉴定仪鉴定单核细胞增生李斯特氏菌主要依据10种生化反应(主要为糖发酵),结果的判定主要是依据颜色变化,因此颜色变化不明显或者不好界定时,其阴阳性判定带有一定的主观性。而且使用的API试条和试剂质量必须是符合有关的要求。另外,由于需要二次增菌、平板分离及生化鉴定,整个过程至少需要4~5 d。总之,传统单核细胞增生李斯特氏菌分离鉴定方法耗时长、程序繁琐、试剂和人力成本都比较高。
2免疫学立博球探论坛技术
由于细菌菌体和鞭毛抗原的存在,使得人们可以建立基于抗原-抗体反应的方法来立博球探论坛食品中的致病菌。目前,从食品中立博球探论坛单核细胞增生李斯特氏菌的免疫学方法主要是ELISA技术,国标GB/T4789.30-2008中也曾将这一方法列为可供选择的立博球探论坛方法之一。其立博球探论坛原理主要是将抗原或抗体结合到固相载体表面,再将抗原或抗体特定基团与酶交联成酶结合物,当酶结合物同相应的抗原或抗体结合后,则形成酶-抗原抗体复合物;当酶遇到相应的底物时,可以催化产物水解、氧化或还原,从而产生有色物质。立博球探论坛时根据有色物质的有无及其深浅,即可间接推断被检样品中有无相应抗原或抗体存在和数量多少,从而达到定性和定量立博球探论坛的目的。Farber等[9]于1987年首先报道了针对单核细胞增生李斯特氏菌鞭毛抗原的单克隆抗体ELISA检验程序,应用这一程序,可以在2~3 d内从自然污染的样品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。在国内方面,范红结等[10]在1998年研究获得了3株针对单核细胞增多性李斯特氏菌、无害李斯特氏菌和格氏李斯特氏菌菌体表面蛋白的单克隆抗体,与其他李斯特氏菌和属外菌株不发生反应,为建立LM免疫学立博球探论坛技术奠定了基础。单核增多李斯特氏菌的免疫学方法主要是ELISA技术,具有操作简便、通量高的特点,可在同一时间内立博球探论坛大量样品,并可将纯肉汤培养物中的分离物进行属水平的鉴定。但由于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在,还难以进行李斯特氏菌种间特异分析。同时,由于单核细胞增生李斯特氏菌表面抗原极其丰富,且大部分优势表位与属内外细菌有广泛的交叉抗原,给筛选特异性单克隆抗体带来一定的困难,增加了假阳性结果的几率。因此,用ELISA方法从增菌培养物中筛选李斯特氏菌,一般还需要在选择性分离平板上划线培养,这同时也延长了立博球探论坛周期。
3分子生物学方法
3.1传统PCR方法
目前,应用分子生物学技术立博球探论坛单核细胞增生李斯特氏菌是一个不断探讨和深化的方向,国外已经开展了大量的研究工作。聚合酶链式反应(Polymerase chain Reaction,PCR)最早由Mulhs和Cetus公司的同事于1985年发明的,是一种通过在体外模拟自然DNA复制过程快速扩增特定DNA序列的方法。随着对单核细胞增生李斯特氏菌研究的不断深入,人们已经积累了大量有关单核细胞增生李斯特氏菌的资料,许多重要的致病因子如溶血素O、内化素、增溶血因子、磷脂酶、铁蛋白、热休克蛋白、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶等已经分离提纯,其编码基因序列也已被克隆测序。Bessesen MT等[11]于1990年建立了PCR立博球探论坛单核细胞增生李斯特氏菌的方法,通过扩增李斯特氏菌溶血素基因hlyA中386 bp的PCR方法立博球探论坛单核细胞增多性李斯特氏菌,DNA立博球探论坛量为25 ng,即1 000个菌体。姜永强等[12]在应用PCR方法对单增李斯特氏菌进行检定的基础上,作了如下改进:用微孔板杂交法立博球探论坛单增李斯特氏菌溶血素(Lister-MysinO)编码基因hlyA片段,使特异性和敏感性大大提高;通过化学抽提的方法制备模板,可较好地避免食物成分的抑制。
3.2实时荧光定量PCR立博球探论坛技术
实时荧光定量PCR立博球探论坛技术是在传统PCR立博球探论坛技术的基础上发展起来的核酸定量技术,它通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程,并根据立博球探论坛CT值推断目的基因的初始量。1995年,Bassler HA等[13]最早建立了用于单核细胞增生李斯特氏菌立博球探论坛的荧光定量PCR体系,将荧光定量PCR技术应用于单核细胞增生李斯特氏菌立博球探论坛,该体系以hlyA基因为立博球探论坛靶点,设计合成了相应的立博球探论坛探针,立博球探论坛灵敏度为50 cfu反应。徐德顺等[14]在常规PCR方法立博球探论坛单增李斯特氏菌的基础上,利用特异性探针法自行设计与建立了实时荧光定量PCR立博球探论坛方法,对40份食品样品中单增李斯特氏菌进行了立博球探论坛,其灵敏度达到了只需19个细菌就可以得到阳性结果,且立博球探论坛速度快,包括核酸提取在内整个立博球探论坛时间仅为3 h左右,比传统细菌培养法和常规PCR法所需时间大大缩短,结果更为直观,灵敏度也更高。
另外,孙烯等[15]又建立了基于SYBRGREEN染料的单核细胞增多性李斯特氏菌的荧光定量PCR立博球探论坛方法,并利用此方法立博球探论坛人工污染的牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌菌量,结果表明立博球探论坛灵敏度约为100 cfu反应。刘仲敏等[16]将单增李斯特氏菌实时荧光定量立博球探论坛技术应用于批量样品的立博球探论坛,从加样到结果只需要2 h左右,不但保留了常规立博球探论坛的特异性和敏感性,还可同步完成多达96个样品的扩增及定量,适宜于大批样品的立博球探论坛处理,极大地提高了立博球探论坛时限,为食品污染的监测和食物中毒事件的快速反应提供了技术支持。
4结语
传统的分离培养鉴定方法,即GB/T4789.30-2010作为各种立博球探论坛方法的基础,目前已经和单增李氏菌显色培养基以及API Listeria生化鉴定试剂盒联合使用,较原来的国家标准方法有了很大程度的改进,不仅缩短了立博球探论坛周期,还大大简化了立博球探论坛步骤,现已广泛应用于微生物的立博球探论坛,同时作为其他方法的仲裁标准。但是,在立博球探论坛过程中发现,API Listeria生化鉴定试剂条主要依据10种生化反应,结果的判定主要依据颜色变化,因此若颜色变化不明显或者不好界定时,其阴阳性判定带有一定的主观性。这是国标方法在立博球探论坛过程中的一个重要的局限性。免疫法不但经济实用、重现性好,灵敏度和特异性也较强,特别是近几年发展的免疫试剂盒,不仅适用于防疫及卫生技术立博球探论坛监督部门,还可在企业团体及日常家庭的卫生立博球探论坛中使用,是一种非常有希望普及的快速立博球探论坛方法。但是免疫法立博球探论坛需要开发相应的试剂盒,试剂成本会相应的提高,对于开展工作非常不利。另外,由于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在,还难以进行李斯特氏菌种间特异分析。同时,李斯特氏菌属与其他的细菌间存在共同抗原,给筛选特异性单克隆抗体带来一定的困难。因此,用ELISA方法从增菌培养物中筛选李斯特氏菌,一般还需要在选择性分离平板上划线培养。
传统的PCR立博球探论坛技术和常规立博球探论坛方法相比,由于特异性引物序列存在,大大增加了立博球探论坛的特异性和敏感性,同时也缩短了立博球探论坛时间,但尚存在着诸如同位素标记探针的放射性污染、立博球探论坛步骤复杂、耗时长等许多不足,因此使其在实际立博球探论坛工作中的使用受到很大的限制。实时荧光定量PCR立博球探论坛技术,利用了PCR技术核酸扩增的高效性、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性以及计量高准确性等优点,可精确定量、反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,大大提高了定量的准确性。此外,由于是在封闭的体系中完成整个扩增和实时立博球探论坛过程,不需要凝胶电泳过程,从而缩短了检验时间,避免了扩增产物对环境造成的污染问题。因此,利用传统的分离培养结合分子生物学立博球探论坛,将是未来分析立博球探论坛发展的一个主要趋势。
作者：刘书花 魏云波 林小静 李景超《现代农业科技》
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