【摘要】 以霉酚酸产生菌1321#为出发菌株，采用紫外线诱变并复合重金属Cr6+、Cu2+抗性株筛选，获得一株遗传性状稳定且摇瓶发酵水平提高86.6%的164#高产菌株。经发酵配方优化，该菌株的摇瓶单位再度提升了5.5%，显示出了高产潜力。
【关键词】 霉酚酸； 诱变； 重金属离子； 抗性筛选
ABSTRACT A mycophenoilc acid (MPA) producing strain Penicillium brevicompactum #1321 was treated by UV, followed by resistance selection with heavy metal Cr6+ and Cu2+. A stable strain #164 was obtained with the potency of MPA higher by 86.6% than starting strain in shaking culture. The potency was further improved by 5.5% in the optimized fermentation medium.
KEY WORDS Mycophenoilc acid; Mutagenesis; Heavy metal ion; Resistant screening
霉酚酸(mycophenoilc acid，MPA)为短密青霉(Penicillium brevicompactum)产生的抗真菌、抗肿瘤并具免疫抑制作用的抗生素［1］。MPA是次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的可逆性抑制剂，能选择性地抑制淋巴细胞活性，它的2-乙基酯类衍生物——霉酚酸酯(MMF)是新一代免疫抑制剂，在临床器官移植和自身免疫性疾病的治疗方面展示了良好的应用前景。做为合成MMF的前体化合物，提高MPA的工业化水平对于生产企业来说十分重要。
MPA产生菌原始菌株的产量有限，其高产菌株的选育研究近年来渐成热点。张琴等［2］报道采用紫外线及亚硝基胍诱变产生菌，以MPA和三氟乙酸为抗性筛选标记，筛选到了高产突变株；杨亚勇等［3］报道紫外线和亚硝酸复合诱变MPA产生菌的原生质体，经原生质体再生获得了高产菌株。本文报道了应用紫外诱变与定向筛选重金属离子抗性株相结合的方式，进行MPA育种研究，并获得了高产稳定的突变株。
1 材料与方法
1.1 出发菌种
短密青霉(Penicillium brevicompactum)1321#。
1.2 培养基及培养条件
(1)分离及斜面培养 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，26℃培养5d～7d。
(2)种子培养 淀粉10g，葡萄糖5g，酵母粉3g，氯化钠1g，硫酸镁0.5g，碳酸钙1g，自来水1000ml，自然pH。26℃，220r/min摇床，培养2d。
(3)发酵培养 淀粉12g，蔗糖50g，玉米浆50g，鱼粉蛋白胨2g，酵母粉13g，硫酸铵4g，磷酸二氢钾1g，氯化钙2g，碳酸钙0.5g，自来水1000ml，自然pH。26℃，220r/min摇床，培养7d。
1.3 菌种诱变与筛选
(1)紫外照射单因子处理 由出发菌株的成熟斜面制得单孢子悬液置平皿中，紫外灯(30W，波长254nm， 距离40cm)照射4～5min， 孢子液适当稀释后涂布于PDA平板培养基上。培养5d后挑取单菌落进行摇瓶筛选。
(2)紫外照射复合Cr6+、Cu2+平板抗性处理 制备含有0.6%、0.7%和0.8%铬酸钠以及0.02%、0.05%和0.1%硫酸铜的PDA平板，将UV处理过的孢子液适当稀释并涂布于含Cr6+、Cu2+平板培养基上，培养5d～7d后挑选孢子丰富、菌落直径相对较大的抗性菌落进行摇瓶筛选。
1.4 发酵液单位立博球探论坛
样品处理 定量吸取发酵液，加入1.5倍的无水乙醇，充分振荡1h，3000r/min离心10min。取上清液由HPLC测效价。
HPLC测定 色谱柱Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm)；流动相为甲醇∶0.1%醋酸(70∶30)；立博球探论坛波长250nm；柱温40℃。
MPA对照品为Sigma公司产品。
2 结果
2.1 菌种诱变系谱
2.2 摇瓶筛选结果
出发菌株1321#经过UV诱变处理结合Cr6+、Cu2+抗性株筛选，最终获得164#高产突变株，其摇瓶产量比1321#提高了86.6%(表1)。
由表1可见，UV+Na2CrO4复合处理筛选到的942#菌株的产量提高幅度最大，随后进行的UV+CuSO4复合处理得到的164#菌株其发酵单位进一步提升。
2.3 高产突变株的菌落形态变化
164#高产突变株的菌落形态与原始菌株1321#相比有了较大变化。1321#为圆形扁平状菌落，而164#的菌落中央凸起，呈对称性放射褶皱状。且有直径变小、孢子量减少的趋势。表1 三种诱变筛选方式获得正变株(系谱菌株)的相对摇瓶产量以出发菌株CK1321#摇瓶产量为100%计。2.4 高产菌株遗传稳定性考察
164#菌株经连续四次斜面传代后与F1代进行摇瓶发酵单位的比较，其子代效价与F1代基本持平。证明该菌株的遗传稳定性良好。
2.5 发酵配方优化
以164#做为试验菌株，对发酵培养基中的淀粉、蔗糖、酵母粉、鱼粉蛋白胨、玉米浆进行U15(155)均匀设计试验。经验证，配方优化后164#菌株的摇瓶单位提高了5.5%。
3 讨论
我公司的MPA产生菌系从土壤中分离得到的野生菌株，经过前期的诱变育种工作，本试验出发菌株1321#的发酵能力已达到产业化水平。为进一步增强产品的市场竞争力，我们面临的任务是选用快速有效的育种手段，短期内将菌种的单位产量大幅提高，以满足生产的需求。
在菌种选育过程中，诱变和筛选方法的选择是十分重要的。Cu2+、Cr6+等重金属离子对微生物有一定毒性［4］，当培养基中的重金属离子达到一定浓度时大多数产生菌的生长被抑制，只有对该金属离子具有抗性的菌株才能生长。抗性的机制可能是由于菌体分泌大量产物或其中间体和有毒的金属离子结合，形成无毒或低毒的复合物以解除对菌体自身的抑制作用［5］，并使之失去终产物的反馈控制。这样就可以从金属离子抗性突变株中筛选到能大量产生目的产物的高产菌株。
我们对1321#菌株采用了包括UV诱变以及UV复合Cr6+、Cu2+抗性筛选的方法，多轮选育后获得164#高产突变株,再经发酵配方优化，其摇瓶产量比出发菌株累计提高92.1%，为生产成本的降低奠定了良好的基础。
作者：娄忻 贾啸静 刘胜利 张华《中国抗生素杂志》
【参考文献】
［1］ 李晓虹，龚炳永，朱宝泉. 微生物来源的免疫抑制剂研究现状［J］. 国外医药抗生素分册，2000，21(6)：271～277.
［2］ 张琴，胡海峰，朱宝泉. 麦考酚酸高产菌株的选育［J］. 中国医药工业杂志，2006，37(7)：452～453.
［3］ 杨亚勇，李长洪，孟文伟. 麦考酚酸产生菌原生质体诱变育种的研究［J］. 中国抗生素杂志，2006，31(10)：587～590.
［4］ 章名春. 工业微生物诱变育种［M］. 北京：科学出版社，1984：206.
［5］ 胡立勇，宋有礼，童村. 杆菌肽产生菌的推理选育［J］. 中国抗生素杂志，1988，13(6)：391～396.
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