【摘要】 目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)临床分离株对几种常用抗铜绿假单胞菌药物的敏感性；探索铜绿假单胞菌临床分离株对亚胺培南和美罗培南耐药性差异与其膜孔蛋白OprD2变化的关系。方法 琼脂对倍稀释法测定142株Pa对亚胺培南、美罗培南等8种常用抗假单胞菌药物的最低抑菌浓度，从中筛出32株对亚胺培南和美罗培南不同耐药表型的Pa，提取外膜蛋白并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离，立博球探论坛OprD2相对含量。结果 耐药率最高的是亚胺培南(54.23%)，其次是环丙沙星(45.07%)、美罗培南(28.87%)、氨曲南(19.72%)、阿米卡星(17.61%)、哌拉西林/三唑巴坦(14.08%)和头孢他啶(11.97%)，头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(9.86%)。呈现多重耐药的菌株占38.73%(55/142)，交叉耐药率高达40.84%(58/142)。在对亚胺培南耐药的菌株中，合并有其他β-内酰胺类抗生素耐药的菌株达到62.34%(48/77)。32株Pa外膜蛋白电泳结果显示OprD2相对含量在耐药组为0～3.5%(其中有一株为8.70%)，敏感组为6.20%～10.20%。在碳青霉烯类耐药组与敏感组之间统计分析P<0.05，耐碳青霉烯类组低于敏感组，但是在亚胺培南耐药、美罗培南敏感组与亚胺培南、美罗培南均耐药组之间差异无统计学意义。结论铜绿假单胞菌耐药菌株常见，且常呈多重耐药和交叉耐药。亚胺培南耐药率高于美罗培南。膜孔蛋白OprD2减少或缺失是我院Pa对亚胺培南耐药的主要原因之一。但在美罗培南耐药中所起的作用，有待进一步研究。
【关键词】 铜绿假单胞菌； MIC； 耐药性；亚胺培南； 美罗培南； OprD2
ABSTRACT Objective To study the activities of some commonly used antibiotics against Pseudomonas aeruginosa, investigate the correlation between the resistance phenotypes and the amounts of outer membrane protein (OpD2) of P.aeruginosa, and discuss the mechanism of different resistant phenotypes in P.aeruginosa. Methods The minimal inhibitory concentrations (MICs) of 8 antimicrobial agents against 142 clinical isolates were determined by agar dilution method. Membrane proteins of 32 strains with different resistant phenotypes to imipenem and meropenem were obtained by SDS-PAGE electrophoresis method and the relative amounts of OprD2 were determined. Results The resistant rate of imipenem was the highest (54.23%), followed by ciprofloxacin (45.07%), meropenem (28.87%), aztreonam (19.72%), amikacin (17.61%), piperacillin/tazobactam (14.08%), ceftazidime (11.97%) and cefoperazone/sulbactam (9.86%). The cross resistance rate to β-lactams was 40.84% (58/142), multi-drug resistance rate was 38.73% (55/142). It accounted for 62.34% (48/77), resistant to the other β-lactams in all isolates resistant to imipenem. Membrane proteins of 32 strains were isolated and determined by SDS-PAGE electrophoresis method. Result showed that the relative amounts of OprD2 ranged from 0 to 3.5% in strains resistant to carbapenems (except
a strain which OprD2 was 8.70%); others were from 6.20% to 10.20% in susceptible strains. The statistic results showed the relative amounts of OprD2 of 27 strains resistant to carbapenems were much than susceptible strains. Conclusions P.aeruginosa was frequently resistant to clinical antimicrobial agents, the most were cross resistant and multi-drug resistant strains. Resistance rate of imipenem was higher than that of meropenem. The loss or diminishment of OprD2 was the main reason for the imipenem resistance of P.aeruginosa in our hospital, but its effect on meropenem resistance deserved further study.
KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa; MIC; Resistance; Imipenem; Meropenem; OprD2
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是临床上常见的引起严重医院感染的条件致病菌之一，大量研究显示Pa对碳青霉烯类抗生素的耐药率日渐上升。许多学者认为仅有OprD2蛋白减少或缺失，Pa可对亚胺培南耐药而对美罗培南无影响，但此结果多数为试验诱导菌株的研究，用于临床株研究的尚少。本研究调查了142株非重复临床Pa菌株对8种常用抗生素的敏感性、科室分布及标本来源情况；从中筛出32株对亚胺培南和美罗培南不同耐药表型的Pa，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分离外膜蛋白，并立博球探论坛OprD2相对含量，探索临床Pa分离株对亚胺培南和美罗培南耐药性差异与其膜孔蛋白OprD2之间的关系。
1 材料和方法
1.1 抗生素敏感性试验
(1)试验菌株 2005年1月～2005年7月四川大学华西医院临床标本中分离到的142株非重复铜绿假单胞菌行体外药物敏感试验，经Microscan Walkaway-40型全自动细菌鉴定仪鉴定。
质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853由四川大学华西医院感染病中心抗感染药物研究室提供；PAO1为铜绿假单胞菌的野生标准株由四川大学华西医学院基础学院微生物室提供。
(2)药品、试剂和仪器 头孢他啶(AZ)、阿米卡星(AMK)、头孢哌酮(CPZ)、哌拉西林(PIPC)、环丙沙星(CPLX)、舒巴坦(SB)和三唑巴坦(TB)均为标准品，购自中国药品生物制品检定所；氨曲南(AZ)为中美上海施贵宝制药有限公司产品；亚胺培南(IMP)为杭州默沙东制药有限公司产品；美罗培南(MRP)为深圳市海滨制药有限公司产品；CCCP和PAβN购自Sigma公司。
培养基为水解酪蛋白(MH)琼脂，购自杭州天和微生物试剂有限公司。
A-400型多点接种仪，英国Denley Instruments有限公司；细菌比浊仪，法国Bio-Merieux公司。
(3)试验方法 琼脂平皿对倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。按照美国国家临床试验室标准研究所(CLSI/NCCLS)推荐方法测定亚胺培南、美罗培南、氨曲南、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、环丙沙星和阿米卡星对142株Pa的MIC值。
(4)统计方法 统计软件为SPSS 13.0，χ2检验法分析亚胺培南和美罗培南耐药率之间统计学意义。
1.2 外膜蛋白OprD2的立博球探论坛
(1)试验菌株 从药敏结果筛选出30株不同耐药表型的Pa，分成三组：第一组为对亚胺培南及美罗培南均敏感的菌株，共3株；第二组为对亚胺培南耐药、对美罗培南敏感的菌株，共10株；第三组为对亚胺培南及美罗培南均耐药的菌株，共17株。另有2株(铜绿假单胞菌ATCC27853和PAO1)对亚胺培南及美罗培南均敏感的菌株，归为第一组。
(2)试剂和仪器 十二烷基肌氨酸钠和十二烷基磺酸钠(SDS)购自Sigma公司；LB肉汤为宜兴市永信生物有限公司产品；Tris由上海Sangong有限公司生产；丙烯酰胺为Merck公司产品；亚甲基双丙烯酰胺为Gincobrl公司产品；甘氨酸和四甲基乙二胺(TEMED)为德国Fluka公司产品；蛋白质分子量Marker购自Fermentas公司。超声细胞破碎仪由美国Sonics＆materials公司生产；高速冷冻离心机产自德国Heraeus公司；凝胶成像系统为美国BIO-RAD公司产品；紫外分光光度计产自Beckman公司；垂直电泳仪美国BIO-RAD公司产品。
(3)试验方法
外膜蛋白的制备 参考国外文献报道方法［1］制备外膜蛋白，具体步骤如下：①25%甘油肉汤保存的菌株在MH琼脂平皿上复苏16h；②挑取单个菌落接种于20ml LB肉汤中，于
外膜蛋白的分离 采用SDS-PAGE法，按参考文献［2］进行，12%分离胶，5%浓缩胶，取纯化的外膜蛋白样品10μl溶于等体积样品缓冲液中，
(4)统计方法 统计软件SPSS 13.0，方差分析法比较三组间OprD2相对含量有无差异。
2 结果
2.1 抗生素敏感试验
(1)142株铜绿假单胞菌对8种抗生素的体外药物敏感试验 结果见Tab.1。耐药率由高到低为：亚胺培南(54.23%)、环丙沙星(45.07%)、美罗培南(28.87%)、氨曲南(19.72%)、阿米卡星(17.61%)、哌拉西林/三唑巴坦(14.08%)、头孢他啶(11.97%)和头孢哌酮/舒巴坦(9.86%)。标本来源见Tab.2，标本科室分布见Tab.3。
(2)亚胺培南、美罗培南耐药性差异 对亚胺培南及美罗培南均耐药的株菌有40株；仅对亚胺培南耐药对美罗培南敏感菌株有11株；仅对美罗培南耐药对亚胺培南敏感菌株0株。亚胺培南耐药率(54.23%)，高于美罗培南(28.87%)，有显著性差异。
(3)多重耐药菌株和交叉耐药率高 大多数耐药菌株为多重耐药、交叉耐药，单一耐药的极少。本实验资料显示，呈现多重耐药的菌株占38.73%(55/142)，其中21.83%(31/142)对β-内酰胺类和环丙沙星均耐药，13.38%对β-内酰胺类、阿米卡星和环丙沙星均耐药，2.11%对环丙沙星和阿米卡星耐药，1.41%对β-内酰胺类和阿米卡星耐药。交叉耐药率高达40.84%(58/142)，其中19.72%(28/142)对两种β-内酰胺类抗生素交叉耐药，11.97%对三种β-内酰胺类抗生素交叉耐药，还有1株对本实验选用的所有抗菌药物均耐药。在对亚胺培南耐药的菌株中，合并有其他β-内酰胺类抗生素耐药的菌株达到62.34%(48/77)(Tab.4)。
2.2 外膜蛋白OprD2的立博球探论坛电泳结果和凝胶成像系统测定OprD2相对含量结果见Fig.1和Tab.5。统计结果显示，第一组与第二组间(P<0.05)、第一组与第三组间(P<0.05)均有显著性差异，可以认为该两组间OprD2量有差异，所以OprD2蛋白的减少或缺失是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因之一。第二组和第三组之间P>0.749(>0.05)，无显著性差异。
3 讨论
Pa是一类无芽孢非发酵革兰阴性杆菌。广泛存在于自然界，当机体免疫力低下时可引起多种感染。据我院临床微生物实验室资料，2003年Pa的分离率在革兰阴性杆菌中仅低于大肠埃希菌居第二位，2004年铜绿假单胞菌升为第一位(华西医院内部资料)。这一结果与国内、外文献报道一致［3～5］。
本实验收集的资料分析可见，Pa感染最多见的科室依次是ICU、呼吸科、胸外科、干部病房、神经外科、神经内科、肿瘤科、感染科、血液科、烧伤科和普外科，分别占31.69%、11.97%、7.04%、6.34%、4.93%、 4.23%、4.23%、3.52%、3.52%、3.52%和3.52%。标本来源中痰标本占绝大部分(88.73%)。从科室分布及标本来源我们可以看出Pa感染的特点：①ICU是医院内感染发生的主要场所，也是Pa感染的重要场所；②Pa感染可以侵犯人体多个器官系统，包括呼吸道、皮肤、胆道、脑脊液和血液等，主要以呼吸道为主，是最常见的医院获得性肺炎的病原体。所以在分析感染病原体的时候我们应该考虑到上述易感因素的存在，合理选择抗生素。
从药敏结果看Pa耐药率相当高，交叉耐药、多重耐药菌株多。1991年Watanabe等认为OprD2蛋白是目前所知的Pa外膜中惟一对抗生素通透有意义的孔道蛋白，具有配体特异性，是亚胺培南的特异结合位点，而头孢菌素、青霉素类等均不能通过OprD2通道，所以碳青霉烯类与其他的β-内酰胺类抗生素无交叉耐药性［6］。但近年国内、外大量报告显示大部分耐药Pa存在交叉耐药(包括氨曲南)，与本实验结果一致，这可能是多种耐药机制(金属酶，高产AmpC酶及外排泵等)同时存在的缘故［7］。IMP耐药率(54.23%)高于美罗培南(28.87%，P<0.05)，比国内外报道的耐药率均高［8，9］，与我院内部2004年统计细菌耐药资料基本一致(华西医院内部资料)。从结果来看，敏感率由高到低是：哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、氨曲南、美罗培南、环丙沙星和亚胺培南。由此可以看出亚胺培南在我院已经不宜作为治疗Pa的经验性选择药物，这可能与我院亚胺培南使用广泛或耐药菌的交叉感染有关。
Quinn等［10］在1986年第一次对膜孔蛋白OprD在Pa对碳青霉烯类药物耐药机制中所起的作用做了报道，OprD分为D1、D2和D3。目前研究发现与亚胺培南耐药有关的为OprD2，Pa外膜蛋白OprD2孔道是小分子的亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道［11］。Suzuki等［12］研究发现，对于仅因OprD2缺失引起的亚胺培南耐药的菌株对美罗培南仍敏感。Trias等［13］也发现这一现象，认为是亚胺培南比美罗培南带有更大的正电荷，所以对于OprD2更具有依赖性。Kohler等［14］认为亚胺培南与美罗培南均以OprD2蛋白减少或缺失作为首要的耐药机制，但美罗培南还需要MexAB-OprM的过度表达作为第二耐药机制。本实验立博球探论坛结果显示立博球探论坛的27株耐碳青霉烯类的Pa中11株有OprD2量明显减少，15株未立博球探论坛到OprD2(明显减少或缺失)，仅1株(66号)为8.70%，OprD2量没有显示减少，可能与其他机制所致耐药有关。统计显示，碳青霉烯类耐药组和敏感组间OprD2量有明显差异，而第二组和三组之间没有OprD2量的差异，并没有因为第三组还存在对美罗培南耐药导致OprD2的量更少。在第二组中几乎都有OprD2的减少，但是对美罗培南却敏感，说明OprD2对美罗培南的影响较小。由于本实验缺少对美罗培南耐药、亚胺培南敏感的菌株，所以难以了解这类Pa中OprD2的情况。Giske等［15］的实验显示一株美罗培南中介亚胺培南敏感的Pa仍然有OprD2量的减少(从mRNA水平分析)。由于这种只对美罗培南耐药而亚胺培南敏感的Pa菌株很少，所以相关研究也极少。故OprD2减少或缺失是Pa对亚胺培南耐药的主要原因之一，但是在美罗培南耐药中所起的作用因缺乏大量临床菌株的实验数据，有待进一步研究，所以监测该类耐药株并研究其OprD2蛋白情况值得关注。
作者：刘永芳 吕晓菊 俞汝佳 宗志勇 高燕渝 陈慧莉 李晓芳 蒋胜 韩乾国《中国抗生素杂志》
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