立博国际，立博官网，立博国际官网，立博指数，立博威廉，立博球探，立博论坛，立博网址-大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药谱及其产ESBLs的研究

【摘要】  目的 了解临床分离的54株大肠埃希菌对氨基糖类苷类抗生素的耐药谱及产ESBLs情况，分析氨基糖苷类修饰酶AAC(3)-II的检出率及该酶的一些特征。方法采用MIC法测定临床分离的54株大肠埃希菌对7种氨基糖苷类抗生素的耐药谱，用NCCLS推荐的酶抑制剂增强纸片扩散法立博球探论坛产ESBLs菌株，并通过聚合酶链反应、克隆测序和测定重组菌耐药谱对aac(3)-II基因进行研究。结果 54株大肠埃希菌对阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、链霉素、大观霉素和奈替米星的耐药率分别为14.8%、77.8%、59.3%、66.7%、68.5%、61.1%、22.2%；共立博球探论坛出产ESBLs菌株34株，占63.0%；aac(3)-II基因在54株大肠埃希菌中检出率为88.5%；质粒转化菌产ESBLs且同时检出aac(3)-II基因。重组菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II对庆大霉素和卡那霉素有耐药性，对其余5种氨基糖苷类抗生素没有表现出耐药性。结论大肠埃希菌对庆大霉素的耐药率最高，对阿米卡星的耐药率最低；耐氨基糖苷类抗生素的大肠埃希菌与其产ESBLs有相关性；重组菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II仅对庆大霉素和卡那霉素产生耐药。

【关键词】  大肠埃希菌； 氨基糖苷类抗生素； 修饰酶； 超广谱β内酰胺酶； 耐药性

    Research on aminoglycoside resistance profiles and producing ESBLs

    ABSTRACT  Objective  To investigate the aminoglycoside resistance profiles and producing ESBLs of clinical Escherichia coli strains and analyze the characteristic of AAC(3)-II.  Methods  MIC tests of 7 aminoglycosides and ESBLs confirmation tests were performed 54 strains of E.coli aac(3)-II gene was amplified by PCR and cloned into pET26b, then and sequenced. Activity of AAC(3)-II was tested by MIC method. Results  The resistant rates of 54 strains of E.coli to amikacin, gentamicin, kanamycin, tobramycin, streptomycin, spectinomycin, netilmicin were 14.8%, 77.8%, 59.3%, 66.7%, 68.5%, 61.1%, 22.2% and 63.0% (34/54) of strains were found producing ESBLs. The positive rate of aac(3)-II gene was 88.5% (45/54). The aac(3)-II gene resistance to gentamicin and kanamycin, but not other 5 aminoglycosides.  Conclusions Fifty-four strains of E.coli had the highest resistant rate to gentamicin while had the lowest resistant rate to amikacin. ESBLs-producing strains were mostly in aminoglycoside -resistance E.coli. The aac(3)-II gene only mediates resistance to gentamicin and kanamycin.

    KEY WORDS  Escherichia coli;  Aminoglycosides;  Modifying enzymes;  Extended-spectrum beta-lactamases;  Antibiotic resistance

     大肠埃希菌(E.coli)是条件致病菌，2002年全国细菌耐药性监测网对所属57家三级甲等医院的调查发现，其临床分离率列第一位(14.2%)［1］。目前国内对大肠埃希菌的多重耐药性已引起很大的重视，对β-内酰胺类、氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides)的耐药机制有较多的研究，但两者相关性的研究还不多。以54株从临床分离的大肠埃希菌为研究对象，测定菌株对7种氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度(MIC)及立博球探论坛其产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，为临床合理有效地应用抗生素提供依据；同时克隆aac(3)-II基因到pET26b，立博球探论坛重组菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II对氨基糖苷类抗生素的耐药谱，为进一步研究aac(3)-II基因奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  实验菌株及质粒

    收集从2005年2～8月温州医学院附属第一医院临床送检的血液、腹水、尿液等无菌体液标本分离得到的大肠埃希菌，纸片法测定其对庆大霉素(gentamicin，抑菌圈直径≤12mm)、卡那霉素(kanamycin，抑菌圈直径≤13mm)和妥布霉素(tobramycin，抑菌圈直径≤12mm)任一或以上耐药菌共54株，其中已剔除重复菌株，细菌标记为WYD加四位流水号(如WYD1094、WYD1102)。细菌的分离鉴定及药敏试验参照全国临床检验操作规程进行，并经法国Bio-Merieux公司VITEK 60细菌鉴定仪鉴定。质控的标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603，宿主菌为BL21(DE3)，pET26b为表达载体，以上菌株及质粒均由本实验室保存。

    1.2  体外最低抑菌浓度的测定

    采用琼脂稀释法测定阿米卡星(amikacin A)、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素(kanamycin)、奈替米星(netilmicin)、大观霉素(spectinomycin)、链霉素(streptomycin)对54株大肠埃希菌的MIC，以大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株，按CLSI/NCCLS(2004)版解释实验结果［2］。

    1.3  超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的立博球探论坛

    ESBLs的立博球探论坛采用NCCLS推荐的酶抑制剂增强纸片扩散法。头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟/克拉维酸(CD3)、头孢他啶/克拉维酸(CD2)纸片为英国Oxoid公司产品。单药纸片(CTX、CAZ)与相应的含酶抑制剂纸片(CD3、CD2)中任何一对的抑菌环直径之差≥5mm为产ESBLs菌株。以大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照株，肺炎克雷伯菌ATCC700603为阳性对照株。

    1.4  质粒的提取及转化

    用质粒提取试剂盒提取临床分离菌株WYD1094、WYD1102的质粒，并转化到感受态细胞BL21(DE3)，涂布于含庆大霉素(8μg/ml)的LB固体培养基中，挑取生长的单个菌落，并分别记作为BL21/WYD1094，BL21/WYD1102。提取转化菌的质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳。按“1.2”及“1.3”方法，对上述两株转化菌对7种氨基糖苷类抗生素的MIC及产ESBLs的立博球探论坛。

    1.5  氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-II的立博球探论坛

    自行设计aac(3)-II基因引物，并在引物上添加酶切位点，上游引物5′-GGCATATGATFCATACG-CGGCAAGGCAAT-3′(下划线处为NdeI酶切位点)，下游引物5′-TTCCCCTCGAGCTAACCGG-AAGGCTCGCAGG-3′(下划线处为XhoI酶切位点)，PCR产物长度为877bp。采用碱裂解法提取细菌质粒DNA。50μl的PCR反应体系中包括：10×反应缓冲液5μl、5mmo/LMgC12 3μl、2.5mmol/L的4种dNTPs Mix 4μl、引物(20μmol/L)各2μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模板2.5μl。PCR反应条件：94℃预变性5min；30个循环为94℃变性1min→56℃退火1min→72℃延伸1min；最后延伸10min。1.2%琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果。阳性PCR产物经纯化后送TAKARA公司双向测通，序列在GenBank上比对。

    1.6  aac(3)-II基因的克隆及重组菌的耐药谱

    选取一份PCR阳性产物经纯化回收，NdeI和XhoI双酶切后与经相同双酶切后的表达载体pET26b连接；连接产物转化到BL21(DE3)感受态细胞并涂布到含卡那霉素25μg/ml的LB固体培养基中；挑取生长的单个菌落，经PCR和NdeI-XhoI双酶切证实为重组菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II；采用琼脂稀释法测定上7种氨基糖苷类抗生素的MIC，同时以BL21(DE3)和BL21(DE3)/pET26b为对照，大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株，结果解释同前。

2  结果

    2.1  大肠埃希菌对7种氨基糖苷类抗生素的MIC

    纸片法示54株大肠埃希菌对庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素其中一种或以上耐药。54株大肠埃希菌对7种氨基糖苷类抗生素的MIC结果如表1所示。

    2.2  大肠埃希菌对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的耐药表型及产ESBLs的立博球探论坛结果

    54株大肠埃希菌对三种氨基糖苷类抗生素的耐药表型如表2所示。用NCCLS推荐的ESBLs表型确证法立博球探论坛到34株阳性菌株，占63.0%。    表1    54株大肠埃希菌对7种氨基糖苷类抗生素表2    54株大肠埃希菌对三氨基糖苷类抗生素的

    2.3  临床分离菌的质粒转化菌结果

    2株转化菌的质粒经提取、电泳后均示一条条带；对氨基糖苷类抗生素的MIC如表3所示；同时均产ESBLs。

    2.4  aac(3)-II基因的PCR及测序结果

    在54株大肠埃希菌中共立博球探论坛出PCR阳性45株(占83.3%)；阳性产物均经测序并在GenBank与已登录的序列作比对，结果一致。

    2.5  aac(3)-II基因的克隆及重组菌的耐药谱结果

    重组菌经PCR和双酶切后证实，aac(3)-II基因成功克隆并转化，重组菌对氨基糖苷类抗生素的耐药结果如表3所示。 表3  2株质粒转化菌及重组菌对7种氨基糖苷类抗生素的MIC(μg/ml)

    3  讨论

    (1)氨基糖苷类抗生素是一类由氨基环醇、氨基糖与糖组成的抗生素的总称，包括庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、链霉素等。氨基糖苷类抗生素依赖电子转运，通过细菌内膜到达胞质中，与核糖体30S亚基结合。虽然这种结合并不阻止起始复合物的形成，但能通过破坏控制翻译准确性的校读过程来干扰新生链的延长，导致细菌的死亡［3］。由于氨基糖苷类抗生素在临床上和动物细菌性疾病的预防与治疗中长期和不合理的应用，使细菌对其耐药性显得日益突出。在本研究中，从临床分离的大肠埃希菌对庆大霉素的耐药率最高，达到77.8%，其次为妥布霉素(66.7%)和卡那霉素(59.3%)，对阿米卡星的耐药率最低(14.8%)，这可能与阿米卡星是经过结构改造、能抵抗氨基糖苷修饰酶的半合成氨基糖苷类抗生素有关［3］。本研究结果与姚蕾等［4］报道的2004年北京地区大肠埃希菌耐氨基糖苷类抗生素的结果基本相似，但卡那霉素的耐药率比姚蕾等报道的高(北京地区为40.6%)，这可能与不同地区有不同的用药习惯有关。大肠埃希菌对奈替米星的耐药只有22.2%，但对其中度敏感的比率却达50.0%，这可能是因为奈替米星作为第三代氨基糖苷类抗生素在结构上作了改进，使得AAC(3)-II对奈替米星的修饰作用受到部分限制但不能完全排除影响［3］。54株大肠埃希菌中有8株细菌对阿米卡星耐药，其中有7株为高水平耐药(MIC≥512μg/ml)且对其他6种氨基糖苷类抗生素也有较高水平的MIC值(均MIC≥128μg/ml)，显然，这种对几乎所有氨基糖苷类抗生素高水平的耐药现象可能存在有多种耐药机制或高水平耐药机制，如16S rRNA甲基化酶［5］。

    (2)超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是指由质粒介导的能赋予细菌对头孢菌素类、氨曲南以及青霉素类广泛耐药的一类酶。有学者认为［6］，以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗生素对细菌所产的大部分β-内酰胺酶稳定，氨基糖苷类抗生素对这一类细菌亦然，特别是对阿米卡星耐药率在20%。在治疗由产ESBLs大肠埃希菌感染时可以采用氨基糖苷类抗生素加头霉烯类抗生素，或氨基糖苷类抗生素加β-内酰胺酶抑制剂类抗生素联合用药方案。段建春等报道［7］，在产ESBLs的大肠埃希菌中aac(3)-II基因的检出率高达80%。在本研究中，共有34株细菌产ESBLs，其中有30株为aac(3)-II基因阳性，占88.2%；在45株aac(3)-II基因阳性的细菌中，有30株产ESBLs(占66.7%)，这个比例比一般的大肠埃希菌中产ESBLs检出率高［8］。将临床分离菌的质粒转化到BL21中，提取质粒并电泳后示仅单一条带；同时立博球探论坛到aac(3)-II基因和产ESBLs，说明这两种基因在同一个质粒上。Patterson等［9］认为氨基糖苷类修饰酶基因与ESBLs基因可在同整合子上，表现出多重耐药。由于在本实验中没有作整合子的立博球探论坛，所以不能认为它们在同一整合子上，但可以认为这两个基因很可能会同时随着质粒而传播耐药性。因此在治疗产ESBLs的大肠埃希菌时，应考虑其可能同时携带有aac(3)-II基因或其他氨基糖苷修饰酶基因，避免使用此类抗生素。

    (3)到目前为止，细菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药的分子机制主要有以下五种：①细菌产生一种或多种修饰酶，使进入细菌胞内的抗生素失去生物活性；②抗生素作用靶位的改变、核糖体碱基发生变化或与核糖体结合的核蛋白氨基酸发生突变，使抗菌药物无法发挥作用；③细菌细胞膜通透性改变，使进入胞内的抗菌药物减少；④细菌通过主动外排(active efflux)机制将已进入胞内的药物泵至胞外；⑤细菌产生16S rRNA甲基化酶。细菌对氨基糖苷类抗生素耐药主要是由于产生了一种或多种氨基糖苷类修饰酶(AMEs)。AMEs分为三大类，即乙酰转移酶(AAC)、核苷转移酶(ANT)和磷酸转移酶(APH)。此类酶作用于氨基糖苷类抗生素特定的氨基或羟基，使抗生素发生钝化，使其降低或丧失对靶位核糖体的亲和力［10］。产AAC(3)-II是大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素耐药中最常见的耐药机制之一［4］。在本研究的54株对氨基糖苷类抗生素耐药的大肠埃希菌中，aac(3)-II基因的检出率为83.3%(45/54)。根据氨基糖苷类抗生素的耐药性分为三种耐药表型(表2)：G-T型、G型和G-T-A型，其中G-T型占多数且全部检出aac(3)-II基因，这与孔海深等［11］报道的结果相类似。这种耐药表型与基因型并不完全一致的原因可能是由于氨基糖苷类修饰酶基因多数由整合子介导，且一个整合子可携带多个修饰酶基因［12］；耐药基因盒的表达不仅依赖于启动子的强弱，而且与启动子的距离远近有关：上游基因表达强，下游基因表达弱甚至不表达［13］。6株对庆大霉素敏感且检出aac(3)-II基因的大肠埃希菌的药敏结果显示，这6株对奈替米星、卡那霉素、链霉素、大观霉素、阿米卡星和妥布霉素中的一种或多种耐药。有学者［3］认为aac(3)-II基因可以以沉默状态存在，表现为不耐药；同时修饰酶在细胞内的定位也可能使有该酶基因的检出但不表现为耐药；而对奈替米星和妥布霉素等AAC(3)-II底物的耐药可能是由于这些菌株中存在的其他耐药机制所致，如产AAC(6′)-I。

    (4)在本研究中，成功地克隆了一株aac(3)-II基因的重组菌BL21/pE26b：：aac(3)-II。重组菌的药敏试验发现，重组菌对庆大霉素和卡那霉素有耐药性，对奈替米星和妥布霉素以及其他氨基糖苷类抗生素没有产生耐药性。这可能是aac(3)-II基因在重组状态下所产生的重组蛋白在蛋白的正确折叠、二硫键形成与天然蛋白质有一定的差别，使酶的活性发生了改变。由于庆大霉素的结构较妥布霉素等简单，其I环3位氨基处于没有其他空间阻隔的状态，易被修饰酶所攻击［3］；同时现在也有学者认为妥布霉素与核糖体结合的部位不止一个，妥布霉素可以以对称或不对称的方式二聚体化后以扩大范围，这样减少修饰酶对妥布霉素的修饰作用而发挥抗菌能力［14］。

综上，大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药谱中，对庆大霉素的耐药率最高(77.8%)，对阿米卡星最低(14.8%)。在对氨基糖苷类抗生素耐药的大肠埃希菌中，ESBLs的检出率较高(63.0%)，为临床上合理选择和使用抗生素提供实验依据。

作者：陈云波 王震 查长森 邹立林 季敬章 彭颖 吕建新《中国抗生素杂志》

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