【摘要】 目的 测定两种氟喹诺酮类药物(FQNs)对肺炎克雷伯菌(KP)的防耐药突变浓度(MPC)，比较其防耐药突变能力，了解突变耐药菌对FQNs的耐药性。方法 肉汤法富集1010CFU/ml的菌液接种于不同浓度环丙沙星及加替沙星琼脂平皿上，采用琼脂二倍稀释法测定环丙沙星、加替沙星对临床分离肺炎克雷伯菌ATCC700603及其耐药突变体的最低抑菌浓度(MIC)、防耐药突变浓度(MPC)。对不同药物浓度筛选出的耐药突变株进行编码拓扑异构酶VIC亚单位基因parC和回旋酶A亚单位基因gyrA喹诺酮耐药决定区的PCR扩增和测序，并测定外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙(Carbonyl Cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP)对环丙沙星和加替沙星MIC的影响。结果 环丙沙星、加替沙星对ATCC700603的MPC分别为4、1.6mg/L，细菌耐药选择指数分别为16、4。两种药物的耐药突变体均出现了gyrA的第83位(TCC→ATC/TTG)均出现了突变，引起了相应氨基酸的改变(Ser83→Ile/Leu)。其中有一株同时也出现了第87位点(GAC→AAC)的改变，氨基酸也由Asp→Asn。除第二步突变体parC第80位点突变(AGC→ATC)，引起氨基酸由Ser→Ile的改变外，其余几株均没有发生parC的突变。MIC测定结果显示，单用两种FQNs及合用CCCP的结果一样。结论 加替沙星限制KP耐药突变株选择的能力强于环丙沙星，KP的耐药突变株对FQNs耐药的主要原因是gyrA和parC基因突变。
【关键词】 氟喹诺酮； 肺炎克雷伯菌； 耐药； 防耐药突变浓度
ABSTRACT Objective To determine mutant prevention concentration (MPC) of two fluoroquinolones for Klebsiella pneumoniae (KP) and compare the capacity of fluoroquinolones to prevent the resistant mutant strains. Methods The KP strain ATCC700603 was enriched in broth, and the bacterial concentrations were adjusted to 1010 colony forming units per milliliter. The minimal inhibitory concentration (MIC) and MPC of gatifloxacin and ciprofloxacin for KP were determined by agar plates dilution method. Quinolone resistancedeternining region (QRDR) of parC and gyrA genes were identified by PCR amplification and gene sequencing. The effect of effluxpump inhibitor CCCP on MICs of gatifloxacin and ciprofloxacin for resistant mutants was determided by agar dilution method. Results The MPC of gatifloxacin and ciprofloxacin for KP strain ATCC700603 were 1.6 and 4mg/L, and the MPC/MIC were 4 and 16 respectively. The all strains had an TCC→ATC or TCC→TTG mutation in codon 83, leading to amino acid change: Ser→Leu or Ser→Ile. At the same time, a GAC→AAC mutation was found in codon 87 which resulted in amino acid change: Asp→Asn. Except for the secondstep mutant, DNA sequencing analysis of parC did not reveal point mutation (AGC→ATC) leading the substitution of a Ile for Ser in 4 strains. As for the MICs, of which the two fluoroquinolones withCCCP were same as the MICs without CCCP. Conclusions The capacity of gatifloxacin for restricting the selection of KP resistant mutants is stronger than that of ciprofloxacin. The mutation of gyrA and parC genes are the primary mechanisms responsing for resistance of Klebsiela pneumoniae to FQNs.
KEY WORDS Fluoroquinolones; Klebsiella pneunoniae; Drug resistance; Mutant prevention concentration
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneunoniae，KP)是兼性厌氧的革兰阴性菌，通常存在于人类肠道及呼吸道，是目前重要的条件致病菌，其发病率［1］仅次于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。氟喹诺酮类药物(FQNs)是治疗KP感染的常用药，由于其广泛应用，KP对其耐药性逐年递增。目前，就新一代FQNs的耐药性及延长其临床使用寿命，国外学者Drlica提出了防耐药突变浓度(mutant prevention concentration，MPC)这一概念［2］，该理论在关注抗菌药物预防细菌耐药变异的同时，对临床医师的用药也起到了重要的作用。关于MPC的研究国内已经开始，但尚未见对KP的报道。本实验测定了环丙沙星(CPLX)和加替沙星(GTLX)对KP的防耐药突变浓度及耐药突变株对二者的敏感性，以期为临床合理应用FQNs药物提供参考。
1 材料
1.1 菌株
受试菌15株，肺炎克雷伯菌ATCC700603(本实验室保存)，14株临床分离菌分别来自华西一附院、四川省二院、宜宾市第一人民医院2006年6月～8月临床分离的对环丙沙星敏感菌。
1.2 抗菌药物
环丙沙星(CPLX广州南新制药有限公司，批号CFI02706)、加替沙星(GTLX浙江亚太药业股份有限公司，批号060206)和羟基氰氯苯腙(Carbonyl Cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP，美国Sigma公司)。
1.3 试剂及仪器
MullerHinton(MH)肉汤、MH琼脂、LB肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)。Taq酶和dNTP(大连宝生物工程有限公司)；DNA纯化试剂盒(北京天为时代)；SDS、EDTA、饱和酚、氯仿、Tris、EB、琼脂糖(博瑞克生物科技有限公司)、高速台式离心机(美国Sigma公司)、DYY6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)、PCR扩增议(eppendorf)、凝胶成像议(冷泉港生物科技有限公司)。
2 方法
2.1 MIC测定及两种FQNs药物联合CCCP对耐药突变株的MIC测定
参照文献［3］推荐的琼脂二倍稀释法测定CPLX和GTLX对临床分离KP、ATCC700603及不同耐药突变株的MIC，在测定MIC的同时，制备含有泵抑制剂CCCP的平板(CCCP终浓度为20mg/L)，与CCCP联用的FQNs的MIC比单用FQNs的MIC降低4倍说明有主动外排机制存在，用大肠埃希S菌ATCC25922作为质控菌。判断按照参考文献［3］标准。
2.2 防耐药突变浓度(MPC)的测定
将CPLX和GTLX倍比稀释成不同的浓度，药液和MH琼脂培养基按1∶9的比例在90mm的平板中混匀，配制成浓度高于MIC的立博国际官网浓度二倍稀释的含药平板，每个浓度4个平板，置37℃孵箱过夜。菌液制备参照文献Zhao［4］的方法，单个菌落过夜培养后集菌，把菌液调至1010CFU/ml，取100μl均匀地涂在制备好的含药平板上，孵育24、48和72h后观察结果，以不出现细菌生长的最低药物浓度为该药对这种细菌的MPC值。
2.3 菌落恢复生长比率曲线的绘制
按照2.2集菌方法集菌后，将1010CFU/ml的菌液倍比稀释成不同浓度至103CFU/ml，将不同浓度菌液100μl涂在含抗菌药物平板上，计数恢复生长菌落数及恢复生长比率，描绘生长比率曲线。
2.4 GTLX和CPLX对ATCC700603耐药突变株的选择及其基因组DNA的提取
按照上述2.2方法集菌后，将100μl的菌液接种于含2MIC～MPC不同浓度的抗菌药物平皿上，37℃培养48～72h，挑取不同浓度平板上生长的菌落，将这些菌落培养2代后接种于原药物浓度的平板上如仍然生长即为耐药突变株，1、2步耐药突变株均按照此方法选择。筛选出的耐药突变株用碱裂解法提取基因组DNA，做为PCR的DNA模板。
2.5 耐药突变株gyrA基因和parC基因的扩增及测序
使用Primer 5.0设计引物，gyrA正向引物为5′TGCGAGAGAAATTACACC3′，反向引物为5′AATATGTTCCATCAGCCC3′扩增片段长度为625bp；parC：正向引物为5′CCAGCGTCGCATCGTCTA3′，反向引物为5′AAAGTTTGGCACCCAGTCG3′，扩增片段长度为319bp。扩增条件：反应体系为50μl，94℃预变性3min，循环参数为变性94℃ 30s，退火gyrA为50℃ 30s，parC为54℃ 30s，延伸gyrA为72℃ 30s，parC为72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min。扩增产物经含EB的1%琼脂糖凝胶电泳后照像(图1)。PCR产物按照产物纯化试剂盒纯化后委托上海英骏公司测序。
3 结果
3.1 GTLX和CPLX对KP临床分离株、ATCC700603及其耐药突变体的MPC、MIC
两种药物对ATCC700603的MIC值：GTLX
N：空白对照； M：DNAmarker；
1～6：分别为耐药突变体gyrA、parC基因扩增产物
图1 gyrA基因扩增产物电泳图(0.4μg/ml)>CPLX(0.25μg/ml)，MPC值：CPLX(8μg/ml)>GLXT(1.6μg/ml)，选择指数(MPC/MIC)：GTLX(4)<CPLX(32)，结果见表1。GTLX和CPLX对ATCC700603选择出的第一步耐药突变体的MIC值较同浓度下ATCC700603的MIC值分别升高5、24倍，第二步又较第一步分别升高了3、5.3倍，结果见表2。两种FQNS药物联合CCCP对耐药突变株的MIC与单用FQNS的结果相同。< p>
3.2 GLXT和CPLX对临床分离株的MPC及MIC值
90%菌株的MIC显示GTLX的MIC值大于CPLX，MPC值小于CPLX，选择指数为GTLX< MIC值分别运用独立样本T检验P
3.3 两种FQNs对KP标准菌的菌落恢复生长比率曲线
随着FQNs药物浓度逐渐增加，细菌恢复生长的菌落数出现两次明显下降。第1次下降发生在MIC99；随着药物浓度增加，恢复生长的菌落数逐渐减少并维表1 GTLX和CPLX对临床分离KP及ATCC700603的MIC、MPC(μg/ml)表2 GTLX和CPLX对ATCC700603的耐药 ATCC700603的第一步耐药突变体和第二步突变体。持在相对稳定的水平(平台期)，药物浓度进一步增加，菌落数出现第2次明显下降，直至药物浓度增高到MPC时琼脂平板中没有菌落生长，由图可见GTLX的平台期明显比CPLX的短，见图2。
3.4 PCR结果
对CPLX和GTLX的耐药突变菌株的gyrA和parC基因进行扩增，经含EB的1%琼脂糖凝胶电泳照相(图1、图3)，不同浓度下的耐药突变菌均扩增出了600和300bp左右的片段产物，N为空白对照，无条带。 GTLX和CPLX的耐药突变株gyrA均出现了碱基的突变，其中第83位氨基酸的密码子发生了由TCC→ATC或TCC→TTG的改变，导致编码的氨基酸出现相应的改变，由Ser83→ILE或Ser83→LEU，其中CPLX的第二步突变体还发生了87氨基酸的密码子改变，GAC→AAC，相应的氨基酸也由Asp87→Asn。除CPLX第二步突变体的parC发生了碱基的突变外其余均未突变，80位氨基酸的密码子由AGC→ATC，相应的氨基酸由Ser80→Ile。结果见表3。表3 耐药突变株的gyrA和parC的突变位点及氨基酸的变化
4 讨论
近年来由于FQNs药物在临床及其他领域广泛应用，KP对FQNs类药物耐药日益严重。研究FQNs的耐药机制，对临床用药、延长药物使用寿命及新药的开发有重要意义。
国外学者研究［2，5，6］表明，细菌对FQNs是浓度累积性的，随着琼脂平板中FQNs药物浓度的增加，恢复生长的菌落数出现两次明显下降，第一次下降是在MIC99时，随着药物浓度的增加，能够恢复生长的菌落数逐渐减少，直至维持在相对稳定的水平即平台期，药物浓度进一步增加，菌落数出现第二次下降，直至药物浓度增高到某一限度时琼脂平板中没有菌落生长，该药物浓度就是防耐药突变体选择浓度(MPC)。MPC是指防止突变菌株选择性扩增的一个阈值［7］，MPC与MIC的比值为选择指数，MPC和MIC之间的浓度范围为选择突变窗(MSW)［8］。不同药物对相同细菌的MPC和MIC值不同，MPC值小、MPC/MIC值小、MSW窄，预防耐药突变的能力越强。本实验测定了CPLX和GTLX对临床分离的KP、ATCC700603及其耐药突变体的MIC、MPC及MPC/MIC值。对于ATCC700603，从细菌恢复生长曲线可见，GTLX的平台期较短而CPLX的平台期较长，也就是说GTLX的MSW较CPLX的窄，突变菌株不容易富集扩增，出现耐药的机会就少，这和文献［9］相符合；从MPC结果来看，MPC加替沙星< MIC)，GTLX
KP对FQNs耐药的主要机制是靶位改变和主动外排增强，KP的靶位改变主要集中在编码GyrA(gyrA和gyrB)和编码拓扑异构酶Ⅳ(ParC和ParE)上，对革兰阴性菌，靶位改变主要集中在GyrA上［12］。本实验研究GTLX和CPLX的耐药突变体在单用及合用CCCP的MIC值没有改变，但GyrA亚基均出现了83位氨基酸的突变，由极性氨基酸变为非极性氨基酸，使该位点的亲水性降低，FQNs药物与DNA回旋酶的亲和力下降，表现为对药物的耐药，也表明了83位氨基酸改变是此实验中导致KP耐药的主要原因，这与文献［13］报道基本一致。CPLX的第二步耐药突变体同时还出现了gyrA 87位氨基酸和parC的80位氨基酸的改变，表明FQNs筛选出的耐药突变体主要是靶位改变，多步耐药突变跟gyrA和parC双突变有关［14］。
综上所述，临床上对于KP感染的治疗策略不应该仅仅着眼于控制感染，在达到控制感染的同时还应该考虑到限制耐药突变株的选择性扩增，阻断第一步突变株的富集，减少耐药菌的出现。本实验显示GTLX限制KP耐药突变株的能力强于CPLX，因此治疗KP感染时，不仅要掌握这两种药物的结构和药效特点，而且还要灵活的改变治疗方案，控制感染的同时达到防止耐药菌的生长。
本实验仅从KP的体外试验进行测定MPC值，至于其在体内的MPC值及两种FQNs药物体内药物代谢动力学，以及FQNs对KP的MPC值与血药浓度的关系，有待进一步研究，如果MPC理论能够通过动物体内试验或人体试验的深入和验证，将会对临床用药方案和药效与评价产生重大影响，并为解决日益严峻的临床耐药问题提供新的思路和方法。
作者：邓晓慧郑风劲 何文富 孙爱慧 刘小康《中国抗生素杂志》
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