摘 要
目的 幽门螺杆菌(Hp)在体外很易发生球形变，目前一般认为是不能培养的退化状态. 而对Hp在环境中生存方式和如何感染大量人群仍不清楚，为此本研究对Hp的形态变化尤其是球形变的返祖进行了研究.
方法 本研究通过对18株Hp在不同条件下的培养，观察其生存及形态变化，并在加有鸡蛋和小牛血清的空弯培养基上及加有血清有布氏肉汤培养基中是进行培养和返祖，观察其变异规律.
结果 Hp可在室温液体中繁殖，18株中观察到3株球形体Hp在室温下的返祖，除常见球形变外的Hp杆状弯曲、长杆状、短杆状、长丝体、巨球体、丝球体、原生质体及细小“S”和弧形变异. 并根据Hp形态变化的顺序及表型，初步发现Hp由典型“S”或多螺旋形态变为杆状弯曲、长杆状、短杆状、然后变为球形、长丝体、巨球体、丝球体、原生质体的规律. 部分变异体在一定条件下可返祖.
结论 Hp易发生多形变化，有一定规律. 可在室温下生长繁殖，球形体可在Hp鸡蛋培养基上或室温液体培养基中返祖. 提示Hp的球形变在其感染和治疗后的复发中起重要作用.
Transformation and reversion of
Helicobacter pylori in vitro
XU Zhi-Min, ZHOU Dian-Yuan, PAN Ling-Jia and SONG Shan
Chinese PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Subject headings Helicobacter pylori; Helicobacter pylori infection; culture media
Abstract
AIM Helicobacter pylori (Hp) is subject to transforming from bacterial to coccoid in vitro. The coccoid form of Hp is considered uncultivable and as degenerative status. How does Hp survive in environment and infect so many people are still unknown.
METHODS Eighteen Hp strains were cultivated under different conditions to show its transformations. Campylobacter jejuni selected media supplied with egg and calf serum (EHP media) and Brucella broth supplemented with calf serum were used to cultivate Hp for reverting coccoid to bacterial under different conditions.
RESULTS Hp can grow in liquid media in room temperature, and 3 out of 18 strains of coccoid Hp reverted to bacterial. Besides coccoid of Hp transformations, curve-bacilliform, long-bacilliform, short bacilliform, long threadlike, giant coccoid, glomerule, trophoplast, and very small “s” or “c” shaped Hp were found. According to the change sequence and phenotype, the variant rules were revealed that typical S-shaped or multi-spiral Hp can change to curve or long or short bacilliform, which may then change to coccoid, long threadlike, giant coccoid, trophoplast or glomerule, some of the variants could revert under certain conditions.
CONCLUSION Hp can easily transform from one phenotype to another as the variant rule, and can live in room temperature and propagate. Coccoid form of Hp can revert to typical form on EHP media or in liquid in room temperature, suggesting that coccoid Hp may play an important role in Hp infection and relapse.
0 引言
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)在体外很易发生球形变，在体内抗生素作用下也可发生球形变［1］. 国内曾报道Hp在一定诱导条件下尚可发生L型变异［2］. 由于人群Hp感染率很高及清除Hp治疗后易复发，Hp的形态变化与其传染或复发是否有关是一个值得研究的问题. 我们通过对Hp在体外培养或生存条件下的形态变化规律进行研究，以揭示Hp可能的传染和复发的规律.
1 材料和方法
1.1 材料 菌株：Hp临床分离株17株、Hp标准株NCTC11637(国外引进，本室保存). 培养基：①固体培养基：普通Hp培养基(空肠弯曲菌培养基琼脂基础+50mL/L冻融羊血)和Hp鸡蛋培养基(添加50mL/L鸡蛋清、1.25g/L蛋黄、30mL/L小牛血清和10mL/L羊血). ②Hp液体培养基(布氏肉汤+100mL/L小牛血清)在1000mL抽气瓶、100mL输液瓶和6mL玻璃瓶中进行，培养液量分别为50mL～100mL，10mL～20mL和1mL～2mL. ③Hp选择性抗生素(Skirrow或Dent选择性抗生素).
Hp特异引物：16S rRNA基因(5’-GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG-3’，5’-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3’)，ureA(5’-GCCAATGGTAAATTAGTT-3’，5’-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3’)，cam(5’-CATCTTGTTAGAGGGATTGG-3’，5’-TAACAAAAAGATAATGGCGC-3’)，PCR试剂，DNA-温度循环仪(Perkin Elmer-480)；原位PCR仪. 抗Hp抗体(日产)，免疫组化试剂及其他常规试剂. 光镜(Olympus)，扫描电镜(Hitachi, S-450)及透射电镜(JEOL，JTM-1200EX). 其他常规仪器.
1.2 方法 Hp分离：采用固体培养分离培养，-70℃保存复苏. Hp的形态诱变：对18株Hp进行固体和液体培养(固体培养：37℃微氧环境培养；液体培养：微氧环境或非换气条件，振荡或非振荡，37℃，室温下培养或4℃保菌). 在不同时间(固体培养2d～7d，液体培养6h～30d)观察不同条件下其球形变及其他形态变异及可能的返祖. 部分经抗生素诱变. Hp形态观察：常规光镜暗视野下观察活菌的形态、动力，Gram染色油镜观察及扫描电镜和透射电镜观察Hp的形态及超微结构. Hp胞壁染色及透射电镜观察Hp细胞壁的完整性. 观察不同时间和不同条件下Hp的形态变化及顺序，探讨其规律. Hp变异体的鉴定：采用免疫组化及PCR和原位PCR鉴定.
2 结果
2.1 球形变 Hp生长缓慢，在37℃微氧环境下固体培养通常需要2d～5d. 液体培养时在微氧环境或非换气条件下，振荡或非振荡培养，37℃或室温下培养均可见Hp增殖. 在培养条件下Hp呈多形性，球形体是Hp最常见的变异形态，在普通Hp培养基上37℃微氧条件下，通常于3d开始出现球形变，5d较多或几乎均为球形体. 在Hp鸡蛋培养基上37℃微氧条件下，一般于2d开始出现球形变，3d较多或大部分球形变，5d几乎均球形变. 在液体培养条件下情况较复杂：Hp增殖较差时较早出现形态不典型或球形变，可数天无明显变化；Hp增殖良好时，一般1d～3d可见球形变(主要与Hp增殖密度和增殖力有关)，大于5d或培养液明显混浊时球形变明显增加；在不同条件下(微氧环境或非换气条件，振荡或非振荡，37℃，室温下培养或4℃保菌)其球形变时间、Hp动力有明显差异.
2.2 球形变的返祖 ①在固体培养基上的返祖：将绝大部分已发生球形变的Hp传种于固体和液体培养基中，仅在Hp鸡蛋培养基上易于传代. 我们将1例在100mL液体培养基中培养至21d的Hp(绝大多数已呈气球样变，暗视野下难以观察到典型Hp)接种于多种培养基上，仅在Hp鸡蛋培养基上有较多典型Hp生长，并动力较好. ②在液体培养基中室温下的返祖：将液体培养主要呈球形Hp 6例留1/2培养液置于4℃～8℃冰箱中保存2d～6d，在3d后移至室温下复苏时有2株出现球形Hp明显减少而典型Hp增多(典型Hp具有较好动力)；另1/2含Hp球形体培养液在37℃下继续培养见Hp球形体增多而难以见到典型Hp. 不同时间将典型Hp(固体及液体培养)置4℃～8℃冰箱中保存2d～7d，于2d～3d可继续传代. 1株(分离自球溃)于振荡培养20d的球形Hp(暗视野观察见绝大部分的均为球形，可见个别近典型Hp)移至室温下，观察后未再抽气(有氧环境)行静止培养4d，培养液混浊更加明显，见大多数为典型Hp而球形Hp明显减少. 其他菌株继续振荡培养观察21d～1mo仍以球形Hp为主并发生气球样变.
2.3 长丝体和丝球体变异及返祖 在同样条件下，Hp发生球形变后一般不易出现其他形态变异. 反复传代中发现1例在Hp鸡蛋培养基上培养至d5时出现较多的长丝体变异：菌体呈长丝状，长度约为典型Hp的3～10倍，有的弯曲缠绕，在革兰染色中粗细不均. 长丝体菌落形态与典型Hp菌落无异；唯较大菌落者长丝体多见. 后传种于新鲜Hp培养基和Hp鸡蛋培养基均能返祖. 再次球形变时间推迟. 另发现1例在Hp鸡蛋培养基上出现丝球体变异：菌体如长丝状，菌体中央出现一个大小不一的球形，Gram(-)，免疫组化(+)，未能返祖.
胞壁染色示Hp球形变者除少数有缺壁外胞壁大多完整，而长丝体多缺壁，长丝体中的巨球体也缺壁，尚未形成巨球体的小球体胞壁多完整.
2.4 其他变异体 在Hp出现明显形态变异过程中常出现一些中间变异，主要表现为：杆状弯曲、不规则杆状弯曲、细长杆状、短杆状、细小S形、弧形和细小颗粒样. 前四者传代时很易回复，而继续培养时形态更加不典型. 球形变Hp久置室温下易发生细小S形、弧形和细小颗粒样变形，但尿素酶试验(-)，电镜示细小颗粒为原生质体.
根据Hp的多种形态变异及与时间和形态变异前后的关系，初步得出其形态变化规律：典型Hp(S形或多螺旋)→杆状(短杆或长杆变异)或者球形变；杆状变→长丝体，而球形体→巨球体、丝球体、原生质体；部分变异体在一定条件下可以返祖成典型的S型Hp.
3 讨论
Hp是一种形态易变的细菌，其主要的变异体是球形体，在过期培养、抗生素作用及体外不适环境下均易发生. 国外对此研究较多. 国内贾继辉尚对Hp的L型进行了研究，发现Hp在羧苄青霉素诱导下可发生长丝体和巨球体变异，且初代不稳定［2］. 一般认为，Hp的球形变是其一种退行变形态，具有生存能力，但不能繁殖，多数是一种接近死亡的形态，在体内外不能回复成典型Hp. 我们在一定实验条件下(接种于Hp鸡蛋培养基37℃微氧或液体培养基非换气室温下培养)观察到Hp的球形体减少而典型Hp明显培养，可在普通Hp平板上传代，提示Hp球形体在体外(接近环境条件)下的存在一定的返祖能力. 提示环境中的异形Hp或治疗后可能的变态Hp的回复可能是Hp感染或复发的机制.
3.1 Hp球形体的活力 目前对Hp球形体的活力存在两种观点. 一种认为Hp球形体是退变的形态，没有意义；另一种观察认为Hp的球形体有一定的活力，在Hp感染治疗后的复发中起一定的作用. Nilius et al［3］对多种抗Hp药物诱导及培养24d老化的Hp球形体行免疫印迹检查发现多条反应带缺失或减弱，结合超微结构认识Hp的球形体是严重退行变的形态. Narikawa et al［4］通过比较抗Hp药物诱导3d～12d的Hp球形体与典型Hp的DNA，RNA及逆转录PCR发现3d后Hp球形体的DNA及RNA仅为典型Hp的1/6.8和1/8.1倍；7d后是典型Hp的1/11.5和1/14.7. 球形体DNA的琼脂糖电泳示弥散而非清晰条带. 尿素酶A的mRNA RT-PCR均为阴性，提示Hp球形变基因组DNA损害且未能修复，是一个退化过程. 而Kusters et al［5］根据Hp尚有半数仍为杆状却失去可培养能力及Hp球形体RNA和DNA量的减少认为Hp的球形体是死亡的细菌. 我们采用改良的Hp鸡蛋培养基对即使只有偶见接近典型形态的Hp(液体振荡培养21d)仍可继续传代，而在一般常用的Hp培养基上通常不能培养，这种培养的差异. 不能用Hp是否能培养确定Hp变异体是否存活的依据，因为目前对Hp的最佳培养条件及不同变异体的返祖条件的认识有很大的差距. 随着Hp球形变时间的延长，其DNA和RNA水平呈进行性下降，但不能因此否认早期球形变Hp便是死亡的Hp，而此时Hp球形体难以纯化，为进一步的研究带来很大的困难. 对Hp球形体的超微结构研究表明，其胞膜完整，部分甚至增厚、胞质均匀与典型Hp无异，部分尚有鞭毛，对上皮细胞的粘附无明显影响，不能排除其早期的Hp球形体仍存活且可返祖. Bode et al［6］对多种抗Hp药物诱导的球形体ATP，RNA和DNA研究表明，其有限的代谢水平可维持RNA，DNA及细胞壁至少3mo，认为用标准的实验室方式不能使Hp球形体增殖或返祖.
3.2 Hp球形体的返祖 目前国内外均未对Hp的球形体在体外返祖成功，且认为一般是不能培养. Cellini et al［7］通过将培养20d的Hp接种于Balb/c小鼠，2wk后检出Hp，推测Hp球形体在小鼠体内返祖. 但Eaton et al［8］同时将典型Hp和Hp球形体接种于悉生小猪，仅典型Hp均定植成功. Chan et al［1］通过HE染色在人类胃内发现Hp球形体，与典型Hp同时检出达82.8%(53/64). 而Lee et al［9］自人胃粘膜分离出的是一种具有潜在致病性的球形体，Gram染色阳性及尿素酶阳性，与Hp的球形体不同. 我们的实验证明，Hp可以在接近环境的液体条件下(室温、非换气、静止培养)生存和繁殖. Hp是微需氧细菌，在静止条件下在远离液面的液体中可以达到微氧条件，尤其在自然条件下合并的需氧菌的生长，消耗氧气更易达到微氧条件. 我们在持续数月的液体培养中捕捉3株Hp球形体在室温下返祖. 由于对返祖规律尚未完全认识，重复较为困难. Hp的球形变返祖提示其Hp的感染 和治疗后的复发中起重要作用，仍需要作进一步的研究，以揭示Hp的变异和返祖规律.
作者：徐智民 周殿元 潘令嘉 宋 姗
单位：第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515
4 参考文献
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