摘要：分别采用固体CFA培养基和液体LB培养基培养，全菌ELISA，口服免疫Balb／c抗体测定，评价肠毒素大肠杆菌抗原CFA／I，CS6和载体志贺氏痢疾杆菌LtX5的免疫原性．结果表明：LB培养基培养不影响疫苗株抗原免疫原性．由此提示，LB培养基对肠毒素大肠杆菌载体疫苗生产是行之有效的．
关键词：肠毒素大肠杆菌；载体疫苗；培养基；免疫
肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli， ETEC) 是引起旅游者和发展中国家婴幼儿腹泻的主要致病菌［1］．目前，疫苗的研制主要是针对定居因子菌毛和肠毒素而进行的，包括灭活菌苗［2］、亚单位疫苗［3］ 、和载体疫苗［4..5］等．
由于疫苗只有在CFA固体培养基上培养，ETEC菌毛才能有效地表达，因此，ETEC灭活苗的研制都是采用CFA固体培养基培养进行生产的．笔者采用基因重组的手段，构建了以痢疾疫苗株为宿主的E T E C 载体疫苗．由于担心液体培养可能会造成ETEC菌毛的严重脱落，所以一直采用固体培养．与固体培养相比，液体培养更为经济、方便，产生污染的机率更低， 更适于生产需求．因此，笔者曾尝试以3种液体培养基，即CFA( 不添加琼脂)，TS(T rypticase Soy broth)，LB(Luria Berteani broth)培养ETEC疫苗，结果发现菌毛抗原能够在3种培养基中表达，且以LB培养基培养的效果最显著，而非CFA［6］．本研究将进一步比较固体CFA与液体LB之间的差别，评价液体培养与固体培养2种模式对疫苗的菌毛表达及免疫原性的影响水平，从而为ETEC疫苗的生产，寻找疫苗生长和抗原表达的合适培养基提供依据．
1 材料与方法
1．1 材料
1． 1． 1 茵株 产生ETEC CFA／I，CS6菌毛抗原的疫苗候选株FWL01 (pZCF16)，志贺氏痢疾杆菌福氏2a疫苗T32的天冬氨酸一B一半醛脱氢酶(aspartateβ-semiaidehyde dehydro genase asd) 基因突变株FWL01［7］．表达CFA／I野生ETEC菌E．coli44813，表达CS6野生 E T E C菌E c o l i 5 1 9 ／ 6 6 A． 野生菌均购自
中国药品生物制品鉴定所．
1．1．2 培养基 CFA培养基(水解酪蛋白10g·L-1 酵母粉115 g·L-1，MgSO4·7H2 O 0．0 5 g·L -1，MnCI 2 0．005 g·L-1，调pH至 7．4 )，普通液体LB培养基．
1．1．3 抗体 抗CFA／I单克隆抗体由瑞典Gobebourgs大学Svennerhom教授惠赠，CS6， LPS多克隆抗体
I．1．4 实验动物 6～8周龄雌性Balb／c小鼠，由军事医学科学院动物中心提供，在 S P F动物房饲养
1．2 方法．
1．2．1 细菌培养 LB培养基培养：将菌株过夜培养物，按1％的接种量接种于新LB液体培养基中，震荡培养16 h．CFA培养基培养：同样取菌株过夜培养物，以1 m L涂匀罗氏瓶， 倒置培养16 h． 培养温度均为37℃．
1．2．2 全菌ELISA 按照文献[8]进行．
1．2．3 动物免疫与抗体测定 按照文献[5]进行．
1．2．4 统计学方法 统计每组样品的ELISA结果，进行t检验分析［9］．
2 结 果
2．1 不同培养条件对疫苗候选株抗原表达水平的影响 疫苗候选株FWL01(pZCF16)是采用生物T程手段，分别将ETEC的2种重要的保护性抗原CFA／I和CS6基因克隆到载体疫苗株福氏2a T32中，通过asd基因的宿主一质粒平衡致死系统来保持质粒，并稳定表达ETEC抗原．同野生ETEC相比，在此疫苗中，ETEC抗原不再受原ETEC表达系统的调控， 而是依赖外源启动子的作用进行组成性表达．将收获的培养物用PB调A 枷值为1，包被酶联板，进行全菌ELISA．2种培养方法的统计结果表明，P>0．05．说明采用LB液体培养， 疫苗候选株生长和抗原表达良好，CFA／I，CS6及宿主LPS (1ipopolysaccharide)菌达到了与 CFA培养基培养相一致的结果(见表1)．
表1 候选疫苗株在不同培养基的抗原表达水平
|
样品 |
CFA/I |
CS6 |
S,flexneri LPS |
|
CFA |
LB |
CFA |
LB |
CFA |
LB |
|
Blank |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
FWL01 |
0.084±0.01 |
0.088±0.002 |
0.084±0.001 |
0.088±0.002 |
0.834±0.001 |
0.871±0.003 |
|
E.coli44813 |
0.418±0.043 |
0.206±0.013 |
|
|
0.034±0.001 |
0.0214±0.001 |
|
E.coli519/66A |
|
|
0.694±0.003 |
0.335±0.010 |
|
|
|
FWL01(pZCF16) |
0.650±0.024 |
0.587±0.010 |
0.363±0.007 |
0.446±0.002 |
0.847±0.003 |
0.851±0.001 |
2．2 不同培养条件对血清抗体IgG的影响 对2种不同方法新鲜培养的候选疫苗株，以相同菌量( 2 x 108 ) 口服免疫各Balb／c小鼠组(每组5只)，2周免疫1次，共免疫3次，每次免疫前进行眼底采血和新鲜粪便收集， 制备抗血清和粪便sI— g A，最后 1次免疫2周后采血．除CF A／I抗体IgG外，经2种不同培养条件培养，ETEC抗原CS6和宿主菌抗原LIPS 2种特异性抗体IgG滴度完全一致．t检验结果P> 0．05，说明对候选疫苗株各抗原的免疫原性没有显著影响．
2．3 不同培养条件对粪便黏膜抗体slgA的影响 对制备粪便抗体进行50倍稀释，测定粪便抗CFA／I和CS6的sIgA抗体含量．数据显示 (图2)，LB液体培养疫苗候选株同CFA固体培养相比，激发机体产生的黏膜抗体sIgA含量稍低． 但 t 检验分析两培养组产生的 s I g A抗体，P>0．05，此结果说明，2种培养方法对候选疫苗株各抗原激发机体内的黏膜抗原抗体反应同样有效．
2．4 不同培养条件对肠液黏膜抗体 s l g A的影响
最后一次采血后，处死Balb／c小鼠，取3 c m 小肠， 剪碎后加400μL 含0．05 mol· L-1 EDTA的0．01 mol·L PBS悬浮，离心，收集上清液，制备肠液抗体slgA．对制备抗体进行50倍稀释，测定抗CFA／I和CS6的slgA抗体．数据显示 (表2)，CFA／I，CS6，经LB液体培养制备的免疫菌在Balb／csb鼠体内产生了较低的抗体低度．t检验结果为P >0．05，表明LB液体培养不影响ETEC抗原CFA／I和CS6的黏膜抗原抗体反应．
表2 不同培养条件下的肠液黏膜抗体slgA含量
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培养基 |
CFA/I |
CS6 |
|
0周 |
6周 |
0周 |
6周 |
|
CFA |
0.06±0.01 |
0.544±0.065 |
0.07±0.004 |
0.526±0.043 |
|
LB |
0.06±0.01 |
0.502±0.105 |
0.07±0.004 |
0.449±0.091 |
Samples were diluted at 1:50
3 讨 论
ETEC流行病学研究结果表明：ETEC定居因子，即为菌体表面菌毛，与小肠黏膜黏附和肠毒素致毒是ETEC腹泻不可或缺的2个必要条件．ETEC疫苗研究结果显示：两者同时又是激发机体产生有效免疫保护的主要抗原，是研制 E T E C疫苗最重要的2种组分．对于野生ETEC，ETEC菌毛的表达，需要Mg2+，Mn2+ 等离子，而且极易脱落．因此，为获得ETEC菌毛的充分表达，传统上一直沿用CFA固体培养基培养．不过，与固体培养相比， 液体培养一直是菌体培养的首选．
载体活菌疫苗是当前 E T E C疫苗研究中最为活跃的类型之一． 特点是免疫接种后， 重组菌能够在机体内繁殖， 产生保护性抗原， 并以载体菌为佐剂，持续激发机体产生特异性免疫性反应．对本研究构建的疫苗候选株FWL01(pZCF16)，ETEC抗原CFA／I和CS6表达不受原ETEC的调控限制．通过比较传统固CFA和液体LB 2种培养基对疫苗候选株抗原表达与免疫原性的影响发现，常规LB培养基无论是菌毛表达和免疫Balb／c小鼠后产生的Ig G和黏膜sIgA抗体方面，都获得了基本一致的实验效果．同时，对载体菌抗原LPS的表达与免疫原性评价结果显示，外源抗原表达不影响载体菌自身抗原的表达与免疫原性， 2种培养方法对载体菌自身的生长和在机体中的免疫作用同样有效． 该结果为本研究和开发ETEC载体疫苗的大规模生产提供了依据．
作者：郑继平1a， 郭桂英 1b，韦双双1a，周海龙1a，张兆山 2
作者单位：1．海南大学a．生命科学与农学院，b．教务处，
2．军事医学科学院 生物工程研究所，《海 南 大 学 学 报 自 然 科 学 版 》
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