在自然界中，各种微生物之间并不是离群索居，彼此老死不相往来的。在任何天然环境中，都有多种微生物共同生活。土壤是微生物的大本营，1克普通的菜园土中就有数百种微生物，个体数量可能超过上亿。连人的口腔中也有几十种细菌。由于巴斯德对葡萄酒变质的研究，人们认识到某种微生物和物质的某种化学变化有直接关系，酵母菌可以把葡萄酒里的葡萄糖变成酒精，醋酸细菌可以使葡萄酒变酸。巴斯德和其他一些学者的工作又证明传染病是由某些微生物感染所致。既然每种微生物有不同的形态和生理特征，他们在自然界的作用和对人类的影响也必然有差异。我们要了解某种微生物对于人类有害还是有益，或者目前与人类还没有什么特别密切的关系，就必须单独把这种微生物分离出来研究。这就是在无菌技术的基础上微生物学的另一项基本技术——纯种分离技术。
要从含有成亿个细胞，成百个种类微生物的样品中分离出某种微生物，并不是容易的事。第一个成功地分离出纯种细菌的，是前面提到过的在手术中采用消毒剂的医生李斯特。关键在于他发明了一种可以取出数量可以小到0.00062毫升牛奶的微量注射器。因为这样才可能使样品中的微生物尽可能少。他用不含任何微生物的灭过菌的水稀释极少量的牛奶，再把稀释的牛奶分装在几个灭过菌的酒杯中，成功地分离出现在还在制造酸奶中采用的乳酸链球菌。这种方法经过100多年的改进，现在仍然是一种分离纯种微生物的常用方法，叫做立博国际官网稀释法。
李斯特的方法毕竟太麻烦了。比李斯特早几年，有位科学家把要分离的样品用灭菌后的水稀释后放在煮熟的马铃薯片上，在温暖的地方培养几天后，马铃薯上长出星星点点的五颜六色的菌落。当时这位科学家认为至少有一部分菌落是由一个细胞繁殖形成的，如果重复几次，就可以分离到纯培养物。不过，真正解决问题的纯种分离方法，是著名的德国医生，伟大的微生物学奠基人之一科赫和他的研究小组建立起来的。科赫在明胶中加上一些营养物质（例如肉质），加热融化后倒在一片灭过菌的玻璃片上，待其凝固后，用在火焰上烧红过，因而烧死了全部原来附着的微生物的白金丝蘸上一点要分离的样品（因为白金丝烧红后很快便会冷却，立即用来蘸样品时也不会烧死样品中我们需要分离的微生物。现在我们用电炉丝代替，价格便宜多了，这就是我们今天常见的接种针），在凝固的明胶上轻轻划动，使样品中的很少量微生物沾在明胶上，然后用玻璃罩盖上玻璃片，以防空气中的杂菌落下污染。几天后，明胶板上便长出一个个彼此分开的菌落。这种方法叫做划线分离法。由于明胶是透明的，所以很容易观察。但是，明胶在摄氏20多度会融化，在一般细菌生长需要的37度下不能成为固体，菌落便不可能形成。科赫的助手黑塞在他妻子的提示下，发现用洋菜（学名叫琼脂，一种做果酱的植物胶）代替明胶，可以克服明胶在37℃会融化的缺点；另一位助手又设计了一种圆形的有边的，可以对着盖起来的培养器具，使得融化的洋菜或明胶不会随便乱流，又可以避免污染杂菌，这就是每个微生物学工作者都非常熟悉的培养皿。从19世纪80年代起，这些分离微生物的特殊用具，成了微生物学实验室必备的特征性物品，至今依旧。
我们马上我们会提出一个疑点：这些在马铃薯片或琼脂上长出的菌落真是由一个微生物细胞繁殖来的吗？可能不是。为了排除这个疑点，当时人们采用反复多次，并仔细用显微镜检查的办法。后来，有人发明了可以在显微镜下用极细的玻璃丝挑取单个细胞的工具——单细胞分离器，纯种分离的技术便成熟了。长期实践的经验告诉我们，尽管不用单细胞分离器有一定风险，但是用稀释法或划线分离法，在适当重复操作后，在很大程度上可以达到纯种分离的目的。
为了获得单一类型微生物，即纯培养物，微生物学家通常采用称作富集培养的技术。所谓富集，就是指在分离纯培养之前，通过这种技术使需要分离的对象在培养基中尽量生长得多一点。为了富集，首先要选择好适合对象微生物的培养基，微生物学家称为选择性培养基。例如，当我们想分离有固氮作用的细菌时，在培养基中可以加糖，但不能用含氮的营养物。在这种培养基中加入一小撮土壤，便只有那些能够利用大气氮的微生物得以生长，因此该培养物就会富含固氮细菌。自然，一旦它们开始生长，有些固定下来的氮就会被土壤接种物中的其它细菌所利用，而随着后者的生长，培养物将变得相当混杂。但培养物中会富含固氮细菌，至少在培养初期是如此。同样，若想得到硫细菌，可在培养基中保留铵盐，并以含硫的营养物取代糖；以硫酸铁代替糖则有助于铁细菌的生长。还可以采用不变更培养基组成而只改变酸度的办法，因为弱酸性含糖培养基有利于酵母菌和霉菌的生长，而细菌却不喜欢这种环境。要分离厌氧细菌，可以让培养基和空气隔绝，简便的方法是使培养基装满到瓶口并塞紧来富集。
根据同样的原理，我们如果想得到具有某种特定功能的微生物，首先可以用选择培养基来进行富集。如果我们想得到能够分解橡胶或塑料的微生物，就可以在培养基中加进橡胶或塑料。虽然我们在自然界中可以见到一些对简单的富集技术无动于衷的微生物，但一般说来，富集培养是寻求微生物纯培养的第一步。
然而，医学微生学家不太采用富集培养方法，原因很简单，因为从一位受感染的患者身上取得的样品就是一份富集培养物，因此医学科学可立即进行第二步工作，即从富集了的微生物中把纯菌株分离出来。
不过我们在实验室中分离纯化的微生物是否与自然界实际存在的完全一致呢？这是个问题。已故的荷兰卓越微生物学家克鲁维教授早就指出，所有的细菌培养物均是实验室的人工产物，为了适应实验室的生长条件，这些微生物的特性已经起了变化。一个简单的例子是引起伤寒的细菌伤寒杆菌，当刚从伤寒病患者体内分离出来时，常常需要向培养基中补加一种氨基酸促进它们生长，但在实验室中培养几次后，它们容易丧失此种特性，即变得能够自己制造这种氨基酸了，当用该菌株去感染实验动物并再度分离它时，它又恢复了需要氨基酸的这一特性。微生物具有惊人的适应性，由此可见一斑。所以我们必须牢记，不要把实验室中微生物材料的表现完全等同它们在自然环境中的情况。
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