立博国际，立博官网，立博国际官网，立博指数，立博威廉，立博球探，立博论坛，立博网址-微生物代谢组学及其应用的研究进展（1）

[摘　要]　代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后系统生物学中形成的另一重要组成部分,也是目前组学领域研究的热点之一。代谢组学技术对理解细胞功能来讲是一种十分重要的功能基因组学技术,因为代谢组直接反应了细胞的生理状态,利用代谢组学技术很有可能去发现细胞新的生化途径并解释其正常的或病理的功能。该文就代谢组学所涉及的技术及其在微生物领域的应用进行综述。

[关键词] 代谢组;代谢组学;微生物

    代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础。代谢组[1](Metabolome)是指某一组织或细胞在一特定生理时期内所有低分子量的代谢产物。代谢组学(Metabolomics)是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后系统生物学的另一重要组成部分,也是目前组学领域研究的热点之一。细胞内的生命活动大多发生于代谢层面,如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等,代谢产物是基因表达的最终产物,基因和蛋白表达的微小变化可以在代谢物上得到放大,因此代谢组学技术对理解细胞功能来讲是一种十分重要的功能基因组学技术,因为代谢组直接反应了细胞的生理状态[2],利用代谢组学技术很有可能去发现细胞新的生化途径并解释其正常的或病理的功能[3]。代谢组学技术在微生物研究中的技术路线一般为:生物标本采集→数据获取→数据分析。本文对该路线中所涉及的方法及其在微生物中的应用进行一综述。

1　生物标本采集

    研究特定条件下培养的细菌的代谢组,首先要对菌体样品进行采集,采集菌体细胞内的代谢产物先要终止其代谢过程即淬火(quenching),然后提取(extraction)胞内代谢产物。

1.1　淬火

    淬火的方法一般有:①用超滤性膜快速过滤后立即冰冻细胞[4];②用高氯酸稀释细胞[5];③在-45℃甲醇溶液中稀释细胞[6];④培养基置入液氮快速冷冻、解冻、离心收集细胞[7];⑤用带有预冷的不锈钢珠的注射器迅速取样、过滤收集细胞[7]。在这些方法中,甲醇淬火液易导致严重的代谢物渗漏,不适用于精确测定细胞内代谢产物的水平;而快速过滤则能获得高水平的代谢产物、氨基酸并阻止三羧酸循环中间产物的逆转,能很好地反映细胞内代谢产物的水平[8];Mashego等[7]报道:用液氮快速冷冻的方法定量分析代谢产物亦不可靠,而用带有预冷的不锈钢珠的注射器迅速取样、过滤收集细胞的方法相对比较适合定量分析代谢产物。

1.2　提取

    代谢组学的分析需要通过特定的试剂把某一组织或细胞在一特定生理时期内所有低分子量的代谢产物提取(extraction)出来。最佳的提取方法应该包括以下几点[9]:①最大限度地提取代谢产物;②对有特殊物理或化学特性的分子无特异性和吸附性;③不通过物理或化学方式破坏或修饰代谢产物。

    目前提取细胞内代谢产物的方法有:①在乙醇缓冲液中煮沸细胞随后在旋转蒸发器中脱水[10];②用高氯酸提取[5];③-45℃甲醇提取[6]。高氯酸提取容易导致大多数代谢产物量的减少或缺失[11],而冷的甲醇可以同时用来进行淬火和提取胞内代谢产物,且不导致有挥发性的代谢产物如丙酮酸蒸发掉,是首选的提取方法[12]。但是Rabinowi tz等[13]最近研究发现冷的甲醇-水(50∶50)液能使三磷酸核苷酸显著降解,导致三磷酸的丢失从而引起磷酸化的核苷酸衍生物(如磷酸盐、核苷、碱基)的丢失,影响对代谢组的研究,进而错估细胞内的能荷;实验中发现酸性乙腈液能使三磷酸根的降解达到最小,减少高能代谢物的丢失及其向低能衍生物的转化,从而提高代谢物的提取量,因此乙腈-甲醇-水-液是提取代谢物的首选。

    适当的取样是代谢组学技术精确和有效的关键,通常的取样技术能引起细胞内代谢产物水平出现误差。抑制代谢物渗漏的影响、减少取样时间的影响、数据的有效性检查均需进一步改进。不同取样方法联用是覆盖微生物细胞内代谢物范围的最佳方法。

2　数据获取

    在细胞内代谢产物提取后紧接着就是如何对这些提取物进行分辨、鉴定和定量分析以获取原始数据。酶分析法虽然特异性高,但是其所需样品体积多,而且一次只能分析一种物质。随着色谱技术和质谱技术的发展,从小体积样品中同时分析多种代谢产物成为了可能。目前应用比较多的方法有以下几种[14]。

2.1　气相色谱-质谱在代谢组学中的应用

    气相色谱-质谱(Gas chromatography coupledto mass spectrometry,GC-MS )在代谢组学研究中是很受欢迎的工具。大多数GC-MS代谢产物分析用于植物代谢组学而不是微生物和生物医学的研究。但是,随着代谢工程领域的快速发展和分析技术的新进展使得GC-MS在微生物代谢组学的应用越来越多。

    GC-M S分离技术的优点是高分离效率(其亮点是能分辨同质异构体)、易用、耐用和低成本。GC-MS 由于高标准化地应用了电子电离,能产生广泛的和高重复性的破裂片段,这使得能够通过配合代谢产物的相对保留时间、滞留指数、质谱裂解谱、已知的可预言的来自数据库的信息去鉴定代谢产物。

    GC-M S最主要的缺点是分析物必须为能挥发的物质。由于大部分代谢产物是不能挥发的,因此,需进行繁复的衍生化步骤是必须的。而且,热不稳定的化合物如磷酸化代谢产物在GC炉中接触高温时容易降解,加之代谢产物对衍生剂有不同的亲和力,使得定量分析不准确,必须使用标准化的衍生化试剂和数据校正手段才能避免这种偏差。另外,衍生化过程中能出现副产品,而且分析物可能会发生转变(如精氨酸转为鸟氨酸,开链糖的成环)和(或)终产物的降解(如三甲基硅烷基衍生物的水解),都会引起对所产生数据的误解。两步衍生化方法(如硅烷化后再甲肟化)能提高待分析产物的范围。

    由于生物样品复杂的性质而要求有效的分离操作和改良的仪器,从而导致了多维分离仪器的产生,如GC-GC tmie of flight(TOF)-MS(全二维气相色谱/飞行时间质谱)技术。这种新方法呈现出很高的峰分辨能力并增加了敏感性,而TOF-MS对改良立博球探论坛提供了非常快的扫描率和额外的敏感性。而且,两个不同GC柱(如极性或非极性)的使用通过选择性的改善为代谢组学分析提供了更大的产物分析范围。

2.2　液相色谱-质谱在代谢组学的应用

    液相色谱-质谱(Liquid chromatography coup led to mass spectrometry,LC-M S)作为一种独立的技术,在分析代谢产物时有显著的优点,这不仅因为不必衍生化分析物,而且还具有能分辨大量代谢物的能力。LC分离与电喷雾(ESI)联用,能使大部分代谢产物被极化和电离以更加利于鉴别。此外,还能通过离子配对(IP)LC-MS、亲水作用液相色谱(H LI IC)MS和反相LC-MS技术从固定相到流动相同时定量分析不同类型的代谢产物。因而LC比GC应用范围更广。

    B rauerMJ等[15]用H IL IC-MS测得大肠杆菌和酿酒酵母菌饥饿应急反应的代谢图谱,在碳或氮源供断情况下,测到68种代谢产物的浓度发生了变化。Wu L等[16]用同位素标记酿酒酵母菌提取物作为内参,用LC-ESI-MS-MS测定了酿酒酵母菌在葡萄糖刺激下的糖酵解和三羧酸循环的中间产物的浓度。LC-MS因其对样品预处理要求简单、立博球探论坛物质的范围更广等优势,因而在代谢组学领域的应用和发展也越来越快。

2.3　毛细管电泳-质谱在代谢组学上的应用

    毛细管电泳-质谱(Capillary electrophoresiscoup led to ma ss spectrome try,CE-MS )在分析复杂的代谢化合物上比GC-MS、LC-MS更有潜在的优势,包括高分辨效率,极小的样品量(nL),方法快捷,较低的试剂消耗。

    Ohashi Y等[17]用CE-MS对大肠杆菌的阴离子、阳离子代谢产物进行了综合和定量分析。在初级代谢中375种带电的亲水中间产物被鉴定,其中的198种被定量,进一步明确了CE-MS能用于微生物代谢领域。

    CE也有一定的局限性,主要是由于其小样品量所致的敏感性降低,尤其是与MS联用时,样品能进一步被屏极液稀释。但是通过减少屏极液流速和使用联机对样品进行预浓缩(如PH介导的堆积和短暂的等速电泳)[18]能得到与LC-MS相似的敏感性。而且屏极液稀释带来的影响可通过使用无屏极界面[3]来解决。

    目前还没有一种技术能轻易分辨微生物提取物中上百种的代谢产物。虽然理论上能精确完成,但是最广泛的代谢产物的覆盖度需要联合多种能互相重叠的分离技术,通过优势互补以分辨不同物理化学特性的化合物。

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