摘 要 以一株从我国山东海域爆发弧菌病鲈鱼体内分离得到的病原菌鳗弧菌(Vibrioanguillarum MV425 O1型)为研究对象，对其实现高密度生产海洋鱼类弧菌病疫苗的培养基进行了优化研究研究表明，碳源和 NaCl造成的渗透压以及 由发酵碳源和氪源导致的pH值变化是影响细胞正常生长的重要因素。海水由微量元素(除铁元素)对菌体生长的作用可被酵母浸出物补偿，高铁浓度有助于菌体 生长。在确定显著影响因子的基础上，采用可旋转中心复合设计方靠和响应面法进行了统计模型优化，优化设计有效地提高了细胞培养密度，实现在摇瓶条件下细胞干重5．8g／L和 30L 规模反应器中26.2g／L的较好的初步放大结果，并可替代海水培养基。
关键词 鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，培养基优化，高密度培养，海洋鱼疫苗
0 引言
随着集约化、高密度养殖的迅速发展，海水经济鱼类养殖业将受到各种鱼类疾病爆发的困扰。如何有效控制这些疾病已成为现今水产养殖业所面临的一个十分迫切的问题。海洋鱼类疫苗作为一种环境友好和及时的疾病控制措施，正受到水产业的广泛重视和积极开发。从产业化角度出发，成功的商业化鱼疫苗必须具备遗传稳定、高生产率和低生产成本特性，而实现后两者的一个主要要求是应用低廉的培养基成分和简单的培养基配制方法。实现单位培养体积的高细胞量。
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种可导致多种海洋鱼类弧菌病 (Vibriosis)的高致病性病原体，在我国，它也是危害多种海洋经济鱼种的主要病害病原体。国外针对鲑鱼类及基于海水培养基的鳗弧菌灭活疫苗已经开发成功多年，但我国目前尚未建立起任何形式的海洋鱼类疫苗的生产体系。鉴于海水培养基的无菌化操作的繁琐和经济性考虑及其它限制，开发新型简易的低成本海洋鳗弧菌疫苗培养基十分必要。本研究采用一株从山东海域海水养殖场爆发弧菌病病鱼体中分离筛选到的鳗弧菌(Vibrio anguillarum MVM425 O1)为出发株，对其实现高密度培养的非海水培养基进行了优化设计。
1 材料与方法
l.l 菌株
鳗弧菌(Vibrio anguillarum，01血清型 ) MVM425从山东黄海海域高密度养殖鲈鱼 (Lateolabraxiaponicus)爆发弧菌病的病鱼体内分离得到，该菌株由本室保藏，具有强弧苗病致病力。
l.2 培养条件
种子培养采用 Luriai-Bertani培养基，补加2％NaCl(LB-20)，于28℃下振荡培养 24h(15O r／min)。培养成熟后按l0％接种量转入装液量50ml的250ml摇瓶．于上述同样条件下振荡培养，培养基为根据具体实验考察对象添加相应营养因素的海洋极限培养基改造而成。微量元素和维生素浓缩液配制参见文献。所有培养基灭菌前，pH值调整至7.5。为防止沉淀和营养因子之间的破坏性反应，分成有机营养、无机盐、微量元素和碳源(含MgCl和CaCl2)四个部分，分别灭菌(0.08MPa，20min)。
1.3 分析方法
菌体浓度采用在550nm下测定OD值，计算单位体积细胞数．细胞干重为高速离心(10000g，10min，4℃)收集菌体后真空干燥，测定相应体积样品菌重 ．计算浓度。
1.4 响应面方案设计和模型分析
在各单因素筛选的基础上，选择蔗糖、NH4Cl和 NaCl为优化对象，采用一种可旋转的中心复台设计进行了优化分析。各独立和非独变量之间的交互作用由下列二次多项式方程给出：（略）
表 1 鳗弧菌(V.anguillarum)高密度培养优化（略）
2 结果与讨论
2.1 营养因素考察筛选
采用上述相应的基本培养基，考察了12种营养因素对鳗弧菌细胞生长的影响 (主要以24h时的细胞终密度为考察指标)。在碳源的筛选实验中，蔗糖和麦芽糖对细胞生长的促进作用明显高于其它碳源，葡萄糖和果糖在浓度不大于1％时对细胞的生长表现为积极作用(见图1)，为双糖促细胞生长效应时浓度的一半 根据等摩尔浓度溶液具有等渗透压的理论，2％的蔗糖和麦芽糖同1％的葡萄糖和果糖溶液的渗透压大体相当。所以，有可能认为高糖浓度对 V.anguilarum生长的抑制作用是由于所造成的超适渗透压环境所致。
关于渗透压对细胞生长的影响见图 2。随着培养基中渗透压的增加(通过添加蔗糖形成).比生长速率(μ )和细胞产量(OD)分别下降了47％和29％左右 当培养基中加入 1mmol／L的甜菜碱(渗透压保护剂)后，这种抑制现象被消除；另外当培养基中含有酵母浸出物时．这种由渗透压带来的抑制现象也被削弱，这可能是由于酵母浸出物中台有天然存在的甜菜碱类物质的缘故。
从各碳源发酵培养的最终pH值来看，另一个潜在的抑制细胞生长的重要因素可能是高糖浓度代谢产生更多的酸导致的过低pH值(见图 3) 继续增加糖浓度，渗透压成为主要影响因素，抑制了菌体生长，继而对底物糖的代谢减少，产酸下降．pH值的下降幅度减弱．最终pH值反而上升。从降低培养基成本的角度考虑 ，蔗糖显然为最佳碳源。
对于氮源来说，NH4Cl和蛋白胨在低浓度时对细胞的生长起正面促进效应。作为一种酸性氮源． NH4 Cl的代谢将导致低的pH值培养环境，从而进一步阻碍鳗弧菌细胞的生长。由于蛋白胨具有一定的缓冲作用，所以它比 NH4Cl在更宽的浓度范围内不呈现明显的不适宜影响。正如图 5所示，使用磷酸盐缓冲液将明显改善细胞的生长。
微量元素(除铁元素)和维生素在所考察的添加量范围内对细胞的生长没有表现出明显的影响：这一结果表明,作为培养基的一个基本和富养组分．酵母浸出物可基本满足鳗弧菌对微量元素和维生素的营养需求。随着铁离子(Fe3+)浓 度添加量从 0至 0.5mmol／L增加，细胞的密度表现出明显的提高(约2倍)。继续增加铁浓度 (0.5～1.0mmol／L)则对细胞的生长促进作用呈现出一种饱和效果 图 6显示．富铁营养将会增加细胞的生长速率并延长对数生长期约4h，从而最终实现细胞密度的提高。
铁作为细菌生长的一种必需营养参与了许多生物过程．如电子传送链和某些 中问代谢酶的辅因子。然而．在有氧条件和近乎中性pH值环境中，铁呈不溶解矿物质状态，类似甚至更为苛刻的铁营养限制也广泛存在于生物系统内．因此，拥有一种特殊的铁摄取系统以克服这种由宿主体或环境造成的铁营养限制对于许多细菌的正常生存至关重要”鳗弧菌V.anguillarum (O1型)多种海洋鱼类弧菌病的病原体正是这样一种生物进化结果的代表性微生物。虽然目前对于铁元素在这一微生物生物过程中的角色问题还不是十分清楚，但已有的事实可以肯定，铁营养的摄取正常与否将严重影响细胞的生长，同时业已证实，这一体系的台成严格受到外界环境中铁离子浓度的调控．在富铁营养环境中生长中，鳗弧菌不台成铁摄取系统；当环境中铁离子的浓度较低时，细胞就会在胞内一质粒的编码下合成此系统：并且由这种铁摄取系统完成的铁输送过程是一种耗能过程；因此，铁浓度增加对细胞生长的显著促进作用可能是由于足够的铁浓度改变了鳗弧菌的代谢响应．节约了为合成一种铁摄取系统所需的营养组分和能量，同时．也节省了运行这套铁摄取系统应该消耗的能量。
需要特别指出的一个现象是，在我们进行铁元素摄取动力学的研究中(将另文发表)证实，高浓度的铁离子可形成矿物化细胞表面，因此，高浓度铁离子对细胞生长的促进作用的另一个机制．可能是由其形成的细胞矿物表面通过增加对可利用底物的转化效率．达到促进有机底物的利用，从而增进了细菌的生长。
2.2 响应面优化
在上述营养因素筛选考察结果的基础上．选择蔗糖、NH4Cl和 NaCl作为进一步优化因素，采用响应面方法建立统计模型。各项变量的模型参数和方差分析结果在此略去．方程相关系数为 0.976，表明所得统计模型可较好地指导实验优化参数。响应曲面图如图 6所示
随着蔗糖浓度的增加，细胞密度在2％(w／v) 糖浓度时达到最大值，继续增加糖浓度将导致细胞密度下降，因此 20g／L蔗糖浓度为最优。同样．从图中可以看到 NaCl浓度也有一个峰值．过低或过高的盐浓度都不利于细胞生长。在 2O～25g／L浓度范围内，细胞生长较好：这一数值同养殖地的海水盐度非常吻合，从另一个角度为“鳗弧菌对海水的依赖更多地是源于海水盐度形成的适宜渗透压环境”的设想提供了佐证。需要特别指出的是，NaCl最适浓度的波动受到蔗糖浓度变化的交互影响，因此，非海水培养基的优化应将模拟这样一种适渗压 环境作为一个重点方面。HCl的最优浓度范围在lg／L左右，同前面单因素考察的数值一致。为了评估统计模型优化数据的可靠性，根据计算优化浓度进行验证实验(共五次)．并同海水培养基进行了对照。取得了平均细胞光密度值0.92， 细胞干重 5.8±0.21g的结果，同模型的预测计算值 0.848较为吻合，同海水培养基条件的l.O5较为接近，证明模型是可靠的，可以作为优化培养基的参考.在30L规模反应器中的初步放大培养中，利用优化培养基取得了细胞干重26.2g／L的较好结果。
3 结论
高浓度碳源和氮源对细胞生长的抑制作用主要是由于它们代谢时造成的低 pH值环境。虽然鳗弧菌V.anguillarum在一定程度上是一种嗜渗压细菌，但过度的渗透压仍将对其生长产生不良影响。基于疫苗生产成本上的考虑，蔗糖和NH4Cl被选择为最佳的碳氯源。采用响应面法对V.anguillarum非海水培养基优化得到最佳碳氮源和盐度为：蔗糖 20g／L，NH4Cl l.0g／L，NaCl 25g／L 。海水中微量元素对细胞生长的作用基本上可被复合培养基组分代替。海水对鳗弧菌生长的最大适应性可能在于其提供的适渗透压环境和矿化表面，优化非海水培养基必须模拟这种环境一高铁浓度对鳗弧菌生长的显著促进作用除了铁营养参与许多胞内重要生物过程外，另一个作用机制可能是其形成的矿化细胞表面促进了细胞对外界营养底物的转化利用效率，本研究的培养基铁元素优化浓度为 0．4mmol／L。 从摇瓶的结果来看，可以预测，反应器的应用将克服许多培养调控操作上的障碍，进一步大幅度提高细胞的培养密度。利用优化培养基实现了 30L规模反应器细胞干重密度 26.2g／L的初步放大结果，为进一步的鳗弧菌疫苗生产开发打下了基础。
作者：马 悦 张元兴 孙修勤
参 考文献 ： （略）
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