立博国际，立博官网，立博国际官网，立博指数，立博威廉，立博球探，立博论坛，立博网址-显色培养基在单核细胞增生李斯特菌快速立博球探论坛中的应用研究（1）

 [摘要] 目的：研究显色培养基对单核细胞增生李斯特菌的立博球探论坛效果，探讨建立新型快速立博球探论坛方法。方法：立博球探论坛按国标GB4789—33程序进行。结果：人工污染样品和实际样品立博球探论坛中，显色培养基CHROMagar Listeria和HKListeria与传统平板OXA和MMA可以达到相同的立博球探论坛限和灵敏度，且具有更高的特异性。结论：用显色培养基立博球探论坛单核细胞增生李斯特菌是一种新途径，可大大提高立博球探论坛效率。

[关键词] 显色培养基；单核细胞增生李斯特菌；快速立博球探论坛              

单核细胞增生李斯特菌(简称“单增李斯特菌”)是一种重要的食源性致病菌，广泛存在于肉类、禽类、乳制品等食品中，引起新生儿脑膜炎和成人败血症等疾病，是食品微生物的常检项目之一。美国食品和药品管理局(FDA)、美国农业部(USDA)、ISO11092标准、国际分析委员会(AOAC)和中国国标(GB4789—33)等都建立了各自的立博球探论坛方法，所用培养基包括OXA、PAL、MMA、MOX、TSA—YE等，但只适用于李斯特菌的选择性分离培养，不能特异性分离单增李斯特菌。目前仍需一种选择性平板可以有效的分离单增李斯特菌。鉴于此，一些显色培养基如CHROMagar Listeria(法国科玛嘉)、HKListefia(广东环凯)等不断开发出来，用于单增李斯特菌的快速立博球探论坛中，直接根据菌落颜色和形态就可对菌种作出鉴定，大大缩短了立博球探论坛时间，提高了立博球探论坛效率。本文通过对人工污染样品和实际样品立博球探论坛，比较了CHROMagar Listeria、HKListeria与传统平板OXA、MMA的立博球探论坛效果。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

单增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC94002、大肠杆菌Escherichia coli 8099、沙门菌Salmonella typhi、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、粪链球菌Enterococcus faecalis、英诺克李斯特菌L.innocua(简称“英诺克”)、威尔李斯特菌L.welshimeri(简称“威尔”)分离株由广东省微生物研究所微生物立博球探论坛新技术发展中心提供。

1.2 培养基及试剂

HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA、MMA、TSA-YE、LB1、LB2李斯特菌增菌液、萘啶酮酸、丫啶黄、李斯特菌生化鉴定管等由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3 主要仪器

法国生物梅里埃公司Biomerieux全自动微生物鉴定系统，API Listeria生化立博球探论坛试剂条。

1.4 样品

试验所用样品猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、熟食、蔬菜、蛋糕等，均采集于附近超市和肉菜市场。

1.5 方法

1.5.1 培养基制备  HKListeria、CHROMagar Listeria、OXA按生产厂家的说明书制备，MMA、TSA-YE按国标GB4789-33法配制。

1.5.2 显色培养基特异性检验   将单增李斯特菌、英诺克、威尔、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、粪链球菌在脑心浸液琼脂，大肠杆菌、沙门菌在营养琼脂培养基上培养24 h后，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA、MMA培养基，37℃培养24 h，观察。

1.5.3 显色培养基灵敏度检验  (1)挑取1环单增李斯特菌加到10 ml 0.85％ 生理盐水中配成原液，然后进行10倍梯度稀释，取10^-4、10^-5、10^-6 菌液各100ul ，分别涂布HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE平板。37℃ 培养36h，计数菌落数。(2)取单增李斯特菌10^-3～10^-8浓度菌液，分别加入2．1×10⁴cfu／ml金黄色葡萄球菌、1.4×10⁴ cfu／ml蜡样芽孢杆菌、1.6×10⁴ cfu／ml大肠杆菌和1.3×10⁵cfu／ml粪链球菌，震荡混匀，取100分别涂布HKListeria、CHROMagarListeia和OXA平板，以10^-3～10^-8 纯菌液涂布TSA-YE做对照，37℃培养36 h，计数单增李斯特菌菌落数，比较在干扰菌株浓度较高而目标菌较低时各培养基的灵敏度。

1.5.4 人工污染样品

1.5.4.1 纯菌污染样品立博球探论坛：将单增李斯特菌梯度稀释后，取10-3—10-8“菌液各1 ml，分别加入到10 g猪肉和9 ml牛奶中，均匀混合2 h。按国标GB47893—33方法增菌，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培养基，37℃ 培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。

1.5.4.2 单增李斯特菌和非李斯特菌混合污染样品立博球探论坛：将单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门菌、粪链球菌近似等比例混合后，10倍梯度稀释成10-3～10-8 不同浓度的混合菌液，各取1 m1分别加入到10 g猪肉和9 ml牛奶中，按国标GB47893—33增菌后，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA培养基，37℃ 培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。

1.5.4.3 单增李斯特菌、英诺克和非李斯特菌混合污染样品立博球探论坛：由于样品中李斯特菌数量一般较少，约1—10 cfu／ml，而英诺克是单增李斯特菌的主要竞争菌，其他李斯特菌对单增李斯特菌影响不大，因此将单增李斯特菌和英诺克按100 cfu：10 cfu、10 cfu：10 cfu和10 cfu：100 cfu 3种近似比例混合，然后加入(10⁴ -10⁵ )cfu／ml金黄色葡萄球菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml蜡样芽孢杆菌、(10⁴ -10⁵)cfu／ml大肠杆菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml沙门菌、(10⁴ -10⁵  )cfu／ml粪链球菌，制成混合菌液，分别加入到9 ml牛奶和10 g猪肉中，按国标GB47893— 33法，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，37℃培养24 h，观察单增李斯特菌在各培养基上的检出情况。

1.5.5 实际样品 从市场购买实际样品共62份，按国标GB4789—33增菌，划线接种HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和MMA平板，观察李斯特菌的检出情况。

1.6 分离鉴定

将疑似菌落进行纯化，用法国生物梅里埃公司API Listeria试剂条，并结合传统生化鉴定方法进行鉴定。

2 结果

2.1 显色培养基的特异性

显色培养基特异性检验结果如表1。HKListeria、CHROMagar Listeia具有较好的特异性，单增李斯特菌呈现蓝色带白色晕环的菌落，威尔和英诺克李斯特菌呈现蓝色无晕环菌落；金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌在CHROMagar Listeia上略有生长，呈现绿色无晕环菌落，菌落形态与单增李斯特菌也有明显区别；在上述两种显色培养基上大肠杆菌和沙门菌等革兰阴性菌均被抑制。与显色培养基相比，OXA、MMA特异性较差，不能特异区分单增李斯特菌。

表1 不同菌株在各种培养基上的生长情况

2．2 显色培养基灵敏度立博球探论坛结果

单增李斯特菌10^-4、10^-5、10^-6 纯菌液在各培养基上的生长情况如表2。对各培养基上的菌落数进行方差分析，P>0.05，表明HKListeria、CHROMagar Listeia、OXA和TSA-YE对单增李斯特菌的检出率无显著差异，其灵敏度相当；单增李斯特纯菌10^-3-10^-8 菌液混合金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌和粪链球菌后，涂布平板的结果如表3。方差分析结果表明，P>0.05，4种培养基的灵敏度相当，当有高数量杂菌存在时同样可以达到相同的立博球探论坛限。

表2 单增李斯特菌在各个培养基上的生长情况(Mean±Sd)

表3 非李斯特干扰菌存在下各培养基上单增李斯特菌数(Mean±Sd)

TSA—YE上为单增李斯特菌纯菌液的涂布结果(对照)

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