沙门菌是食源性致病菌中一个主要的属，在各类细菌性食物中毒事件中，沙门菌造成的食物中毒位居前列〔1，2〕。常规的沙门菌立博球探论坛方法费时费力，已经不能满足食品生产质量控制的要求〔3〕。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法。Notomi等开发出一种新的恒温核酸扩增法—环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)〔4，5〕。本研究利用DNA环介导恒温核酸扩增法对市售不同生肉来源的沙门菌进行快速立博球探论坛，并且着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行验证，以建立的LAMP反应条件能够对今后病原微生物的立博球探论坛研究工作提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 菌株 猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种ATCC13312(S.ATCC13312)(广东省微生物研究所)；其余5株沙门菌HB009，HB371，HB069，HB215，HB143分别分离自市售的生猪肉、海产品、生牛肉、生羊肉和鸡肉。其他属菌株共14株保藏于本实验室，作为沙门菌环介导恒温核酸扩增反应特异性试验中的对照菌株。所有菌株均保存在质脂双层(LB)培养基中。
1.2 仪器及试剂 HtPot40恒温金属浴(合肥艾本森科学仪器有限公司)；PCR扩增仪ABI2700(美国ABI公司)；凝胶成像系统(BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统)。Bst大片段DNA聚合酶(爱尔兰Biolabs公司)；甜菜碱(分析纯，美国Sigma公司)；琼脂糖以及引物合成(大连TaKaRa生物公司)。
1.3 方法
1.3.1 LAMP反应引物设计 以沙门菌的属特异性基因invA〔6，7〕为靶基因，选择位于8 091～331之间的DNA序列作为LAMP扩增区域。将待扩增的DNA分为6个独立的区域，根据这6个区域分别设计LAMP反应所需2对引物(内引物FIP和BIP、外引物F3和B3)。FIP由F2和F1C两部分组成，BIP由B2和B1C两部分组成，其2个部分都能分别识别靶DNA正义链和反义链独立区域。外引物F3和B3分别识别靶DNA上F2和B2的外侧的独立区域，F3序列是5′-gcaacagctacgtgatga-3′；B3序列是5′-ctctattgccggcatcatta-3′。2对引物识别靶DNA上6个独立区域。FIP由22个碱基F1C和20个碱基F2，以及中间连接的TTTT组成，序列是5′-cttagatccccgcattgttggttttccgccacatattatcgcgat-3′；BIP由21个碱基B1C和20个碱基B2，以及中间连接的TTTT组成，序列是5′-gaccatcatgaatggtcagcattttattggcggtatttcggtcta-3′(引物由大连宝生物公司合成)。
1.3.2 LAMP反应 (1)DNA模板制备：DNA提取参照文献〔8〕。(2)LAMP反应体系：25μl反应混合物包括各1.6 μmol／L的FIP和BIP，各0.2 mol／L的F3和B3，1×恒温缓冲液，1 mol／L的甜菜碱，6 mmol／L的MgSO4，1.6 mmol／L的dNTP，8 U／μl的大片断DNA聚合酶，1 μlDNA。(3)反应过程：除了大片断DNA聚合酶，将其余的试剂混合物于95℃反应5 min，使DNA变性。然后迅速于冰上冷却，并加入Bst聚合酶，将反应物混匀，置于65℃恒温金属浴中反应60 min，最后在80℃条件下反应5 min结束反应。(4)LAMP产物立博球探论坛：肉眼观察反应物的外观变化并在2％琼脂糖凝胶上100 V电泳分离25 min，加样量7 μl/上样孔。凝胶置于EB中染色10 min，水洗10 min，在BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统下照像立博球探论坛。
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