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录入时间:2011-11-7 15:06:28 来源：互联网

一. 目的

掌握RT-PCR技术的一般原理和操作步骤

二.原理

PCR(聚合酶链式反应)技术是利用从嗜热水生菌(Thermasaquaticus)中提取或经基因重组合成的耐热DNA聚合酶(常用TaqDNAPolymerase)在高温下快速扩增位于两段已知序列之间DNA片段的技术。PCR过程包括：一.DNA模板的变性(94-95℃),二.单链DNA模板与引物的退火(45-55℃)，三.引物的延伸(72℃),这三步经25-30个循环而完成了PCR的全过程。

三.材料、试剂及仪器

病毒侵染的植株和健康对照总RNA或病毒RNA，3 ’特异性引物1，5’特异性引物2 ，AMV 反转录酶，5X 反转录buffer ，10mMdNTP，TaqDNAPoiymerase ，10 ×TaqDNAPoiymeraseBuffer(内含50mM/LKCL 、10mM/LTris.Cl(pH8.3)、1.5mM/LMgCL),ddH2O。

液体石蜡，小离心管，移液器，PCR扩增仪。

四.步骤

1．反转录（RT ）

反应体系：
            ddH2O              μl
            5X反转录Buffer        10μl
            10mMdNTP           3 μl
            RNasin             40u
            模板RNA              0.1-1 μg
            3’端特异引物            0.1 μg
            AMV反转录酶            10
            总体积                50 μl

反应条件：42℃ 1-2小时。

2．PCR扩增

反应体系：
            ddH2O                      μl
            10×PCRbuffer               10μl
            10mMdNTP                   0.5 μl
            5’引物(0.1ug/ μl)            1μl
            3’引物(0.1ug/ μl)            1μl
            TaqDNAPolymerase           2-5u
            模板反转录产物                    1-5μl
            总体积                        50 μl
            石蜡油                        70 μl

反应步骤：

循环变性退火聚合
1    94℃ 5分钟   55℃ 1分钟   72℃ 2分钟
2   94℃ 1分钟   55℃ 1分钟   72℃ 2分钟
末轮循环   94℃ 1分钟   55℃ 1分钟   72℃ 7分钟

3. 电泳立博球探论坛与分析

PCR反应完毕，取6-8 μl反应产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳立博球探论坛，选择合适的DNA 分子量标准作对照。

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