一、实验目的和内容
目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观察方法。
内容：1.学习细菌单染色操作技术。
2. 用单染色法或负染色法观察口腔中的微生物。
二、实验材料和用具
大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌种。
吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水；
显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。
三、操作步骤
(一)单染色法
1．涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2(图7—1A、B)。
2．干燥 将涂片于室温中自然干燥。
3．固定 手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图7—1C)。
4．染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min（图7—1D）
5．水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图7—1E）。
6．干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体（图7—1F）。
7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。
(二)口腔微生物的观察
1．单染色法
(1)在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，涂成薄膜。
(2)将涂片于室温中自然干燥后，按上面单染色法的步骤，进行固定、染色、水洗，干燥后镜检。
2．负染色法
(1)在洁净无油腻的载片的一端滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，然后加少许黑色素溶液，充分混匀。
(2)另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端，然后推向另一端，则含菌载片上的混合液被推成薄膜。
(3)于室温中自然干燥。
(4)镜检：将光线调亮，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。
四、注意事项
载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。
五、实验报告
(一)绘图
1．单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。
2．你所观察到的口腔微生物的形态图，并注明使用的染色方法，菌体和背景的颜色。
(二)单染色法和负染色法操作要点。
七、问题和思考
1．涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?
2．制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察?
3．你知道口腔中通常存在哪些微生物吗?如何进行区分?
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